山羊乳含有丰富的营养成分,是一种潜在的人乳替代品。但是,山羊乳中不但含有人过敏原β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,BLG),而且其乳铁蛋白含量远低于人乳。人乳铁蛋白(human lactoferrin,hLF)是一种多功能糖蛋白,具有促进铁吸收、抗菌、抗病毒、抗癌和抗氧化等多种生物学功能,是一种十分理想的食品添加剂和药物。近年来,研究者使用体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer,SCNT)等转基因技术生产了一批转人乳铁蛋白家畜,但由于之前的方法存在着技术难度大、成本高、周期长和后代发育异常、存活率低等问题,未能被推广至产业化生产中。CRISPR/Cas9技术作为近几年最热门的基因编辑技术之一,可以高效地精确编辑动植物基因组,是生产转基因动物的理想方法。目前,研究者利用CRISPR/Cas9技术已经获得了基因敲除或敲入的兔、猪、绵羊、山羊和牛个体,但至今尚未有利用CRISPR/Cas9技术获得BLG敲除和hLF定点整合山羊的报道。鉴于此,本试验以山羊为研究对象,首先,建立CRISPR/Cas9介导的山羊BLG基因打靶系统;其次,在细胞水平上利用CRISPR/Cas9技术成功地在山羊BLG位点敲入hLF基因,并且比较了不同浓度RS-1对敲入效率的影响;然后,探究了显微注射CRISPR/Cas9系统获得BLG基因敲除山羊和hLF敲入山羊的可行性;最后,分析了BLG基因敲除对泌乳期山羊乳蛋白基因表达与乳汁中BLG蛋白表达情况的影响。主要研究结果如下:1.CRISPR/Cas9介导的山羊BLG基因打靶系统的建立本试验为了探究CRISPR/Cas9系统能否有效编辑山羊耳成纤维细胞BLG基因座,以及比较不同转染方法下Cas9编辑效率的差异。本试验针对山羊BLG基因第一外显子设计了 3条sgRNA,构建了 3个打靶BLG基因的Cas9-sgRNA表达载体:pCas9-sg1、pCas9-sg2和pCas9-sg3。然后,将3个Cas9-sgRNA表达载体分别转染至山羊耳成纤维细胞(GEFs),72 h后收集细胞提取DNA,PCR扩增打靶区域,使用T7EN1法分析打靶效率,使用桑格尔测序法鉴定打靶区域的突变情况;PCR扩增打靶位点5’端和3’端约1500 bp基因组片段作为同源臂,连接至T载体构建成pβHA-1载体,以pBHA-1为骨架载体插入hLF基因和NEO-IRES-EGFP片段构建了BLG打靶载体pBHA-hLF-NIE;分别使用脂质体法和电转染法将pBHA-hLF-NIE打靶载体转染至GEFs,72h后收集细胞,用流式细胞仪进行转染效率分析。测序结果表明sgRNA引导序列成功插入Cas9-sgRNA表达骨架质粒(pX330),且pBHA-hLF-NIE打靶质粒构建成功。流式细胞仪分析结果表明电转染方法的效率显著高于脂质体转染方法(15.97%± 1.56 vs 2.38%± 0.10,P<0.05)。T7EN1分析结果发现使用脂质体转染组打靶区域的编辑效率低于检测水平,而电转染组打靶区域编辑效率为6.00%～10.0%;桑格尔测序结果表明脂质体转染组中GEFs打靶区域无突变,而电转染组中GEFs打靶区域突变克隆率为8.00%～12.5%。以上结果表明:(1)CRISPR/Cas9系统可以有效地编辑山羊BLG基因座;(2)pBHA-hLF-NIE载体在GEFs中可以成功表达EGFP蛋白,表明其标记基因成功表达,该质粒可以应用于下游的敲入实验;(3)电转染法较之脂质体转染法有更高的转染效率,在接下来的细胞实验中可以采用电转染法来提高总体的打靶效率。2.利用CRISPR/Cas9在山羊BLG位点敲入hLF基因及敲入效率的优化本试验旨在利用CRISPR/Cas9系统敲除山羊基因组中BLG基因,并在该位点敲入hLF基因,同时探讨不同浓度RS-1对同源重组效率的影响。本试验首先将pCas9-sg 1表达载体和打靶载体pBHA-hLF-NIE共转染至GEFs,分别用0、5、10和20 μMRS-1处理细胞72 h,传4代后进行流式计数统计绿色荧光细胞比例;同时将不同浓度RS-1处理后的GEFs用800 μg/mLG418进行筛选,挑取EGFPP阳性单克隆,然后通过PCR和测序鉴定hLF定点敲入的单克隆。试验结果发现:细胞在经过RS-1处理72 h后,贴壁细胞数减少,20 μMRS-1处理组最为明显;在无药物筛选的敲入实验中,敲入效率与浓度呈正相关;在G418筛选出单克隆的试验中,RS-1浓度0-10 μM时,敲入阳性率随着RS-1浓度增加而升高,在10 μM时敲入阳性率最高,为32.61%,然而在20μM时敲入阳性率下降至22.22%,且衰老的单克隆增多。本试验利用CRISPR/Cas9系统顺利获得BLG敲除和hLF敲入的GEFs,且结果表明合适浓度的RS-1可以显著提升定点整合阳性克隆率。3.CRISPR/Cas9介导的BLG基因敲除山羊和hLF敲入山羊生产可行性研究为了更简便快捷地获得BLG敲除奶山羊,本试验将Cas9 mRNA和sgRNA注入山羊单细胞胚胎中,然后移植到同步的受体中,从而获得基因编辑后代。提取新生羔羊基因组DNA,然后通过PCR、T7EN1分析和桑格尔测序法来鉴定后代基因型;为了获得转hLF基因的奶山羊,本试验将Cas9mRNA、sgRNA和同源重组模板质粒三者的混合物注射至单细胞奶山羊胚胎,然后一部分胚胎留存进行成熟培养,培养5-6d后,扩增全基因组DNA,然后使用PCR法进行基因型鉴定,另一部分胚胎移植至同期的受体中,怀孕、分娩得到后代,使用PCR法进行基因型鉴定;PCR扩增预测的脱靶位点,使用T7E1法进行脱靶分析;PCR扩增成功打靶个体各器官组织基因组打靶区域并使用T7EN1法分析其编辑情况。结果表明,单sgRNA打靶效率为6.66%;低浓度双sgRNA打靶效率为25.00%,高浓度双sgRNA打靶效率为28.60%;胚胎和后代个体中,hLF基因敲入效率为0%;此外,所有预测的脱靶位点均无编辑现象;BLG基因编辑成功个体各器官、组织均被匀质地编辑,但其中大部分个体为嵌合体。以上结果表明,通过显微注射Cas9 mRNA和sgRNA至山羊单细胞胚胎可以有效获得BLG基因敲除奶山羊,提高Cas9mRNA和sgRNA浓度可以明显升编辑效率,但是可能会导致嵌合现象,所有BLG编辑后代均未发现脱靶现象。本试验为通过CRISPR/Cas9介导的一步法获得基因编辑家畜奠定了研究基础,同时为进一步研究BLG蛋白敲除山羊表型变化提供了研究模型。4.BLG基因敲除对泌乳期山羊BLG蛋白和其它乳蛋白基因表达影响的研究本试验旨在分析BLG基因敲除对泌乳期山羊乳蛋白基因、乳汁中BLG蛋白表达及乳品质与野生型山羊的差异。首先,通过人工注射激素催乳,收集泌乳期BLG基因敲除山羊和野生型山羊乳样和乳腺组织,提取乳腺组织DNA和mRNA。然后,PCR扩增sgRNA基因组打靶位点片段以及对应的cDNA片段,连接T载体测序;使用乳品自动分析仪分析BLG敲除奶山羊与野生型奶山羊乳品质差异;使用qRT-PCR分析乳腺组织中各乳蛋白基因表达;使用SDS-PAGE电泳分离乳清蛋白,接着结合考马斯亮蓝染色法和Western Blot分析乳清蛋白变化与BLG蛋白的表达差异。。qRT-PCR结果表明乳腺中BLG基因表达极显著(P<0.01)下降,其余乳蛋白基因CSN1S1、CSN1S2、CSN2、CSN3和LALBA均显著(P<0.05)降低;考马斯亮蓝染色结果表明BLG双等位基因敲除奶山羊乳清蛋白中BLG蛋白条带消失;Western Blot检测表明BLG双等位基因敲除奶山羊乳清中无BLG蛋白表达。本试验成功分析了 BLG基因敲除对泌乳期奶山羊乳品质、乳汁中BLG蛋白表达以及乳腺中乳蛋白基因表达差异,证实BLG基因的双等位敲除可以有效去除奶山羊乳汁中的BLG蛋白,为日后在实际生产中获得无BLG蛋白“人源化”山羊乳奠定了研究基础。