一、研究背景鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC）是我国常见的恶性肿瘤,好发于华南方地区,其发病有明显的种族地区和家族地区聚集现象。据估计,世界上80%的鼻咽癌发生于我国。鼻咽癌发病率占头颈部肿瘤的首位,发病年龄在3-84岁之间,以30-50岁多见,男性发病为女性的2-3倍。鼻咽癌已经成为严重威胁我国人民生命和健康的十大恶性肿瘤之一。鼻咽癌多属低分化鳞状细胞癌,大多数对放射治疗有中度敏感性,其邻近结构对放射线亦有较高的耐受性,因此,目前治疗鼻咽癌的主要手段是放射治疗结合全身化疗。但临床发现患者的放射敏感性存在个体差异,导致治疗效果亦出现很大的不同。影响肿瘤细胞放射敏感性的因素很多,细胞凋亡是重要因素之一。自1972年Kerr发现自然界存在细胞凋亡现象以来,人们对凋亡的认识不断加深,并陆续发现了如Bcl-2等一系列的凋亡调控基因,同时也促进了鼻咽癌细胞凋亡机制的研究。糖基化是真核生物细胞表面常见的翻译后产物修饰反应中的一种。糖蛋白中的糖链直接影响着糖蛋白生物功能的发挥。蛋白的寡糖链参与了分子识别以及细胞与细胞间、细胞与间质间的识别、黏附和受体作用等多种生物功能。糖链表达量及结构的改变是普遍的恶行生物行为。细胞癌变时癌细胞膜上糖蛋白的寡糖链发生改变,即糖基异常化（aberrantglycosylation）,各种异常糖蛋白糖基可影响细胞的正常功能,如细胞识别和黏附功能障碍,是导致细胞恶性转化的分子基础研究。而异常糖基化常因肿瘤细胞高尔基体上的糖基转移酶表达水平改变所致。N-糖链分支增多常与肿瘤的转移相关,如N-乙酰氨基葡萄糖转移酶（GnT-Ⅴ, Mgat5,能够催化形成形成β1,6-乙酰氨基葡糖分支结构）。许多研究以表明,GnT-Ⅴ活性增高以及其糖基化产物增多与细胞活力、浸润能力、以及转移能力密切相关。GnT-Ⅴ活性在许多恶性肿瘤组织中表达增高,如乳腺癌、肝癌、神经母细胞瘤、胆管癌以及鼻咽癌等,但是在非小细胞肺癌中恶性程度越高,其表达量越低。关于RNA干扰（RNA interfering, RNAi）现象是由与靶基因序列同源的双链RNA （double-stranded RNA, dsRNA）引发的广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程。细胞中的核糖核酸酶Ⅲ家族成员之一的,dsRNA特异性的核酸酶Dicer将dsRNA裂解成由21-25个核苷酸组成的小干扰RNA （small interfering RNA, siRNA）,随后si RNA作为介导子引起特异性地降解相同序列的mRNA,从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制。肿瘤分子靶向治疗是指在肿瘤分子细胞生物学的基础上,利用肿瘤组织或细胞所具有的特异性（或相对特异的）结构分子作为靶点,使用某些能与这些靶分子特异结合的抗体、配体等达到直接治疗或导向治疗目的的一类疗法。分子靶向药物以某些肿瘤细胞膜上或细胞内特异性表达的分子为作用靶点,从而能够更加特异性地作用于特定肿瘤细胞,阻断其生长、转移或诱导其凋亡,抑制或杀死肿瘤细胞,达到控制肿瘤的目的。二、研究目的鼻咽癌是我国的高发肿瘤,目前关于GnT-Ⅴ表达与鼻咽癌关系的相关研究较少,本试验利用RNAi原理及技术,合成针对多数肿瘤细胞鼻咽癌中高表达基因GnT-Ⅴ的shRNA表达质粒,将其转染人鼻咽癌细胞株CNE-2,观察GnT-Ⅴ的表达变化对鼻咽癌细胞株体内增殖及转移能力的影响。目的就在于能否在鼻咽癌的分子靶向治疗中找到一个新的靶点,并提供客观试验依据。三、实验方法1、GnT-ⅤshRNA质粒制备：由上海吉玛公司完成。2、细胞培养：转染成功的人鼻咽癌细胞株CNE-2/NC、CEN-2/2224在37℃5%CO₂条件下,培养于含10%新生牛血清及2000ug/ml G418的RPMI-1640中,每周传代2～3次。CNE-2细胞培养至对数生长期。3、裸鼠皮下成瘤实验取对数生长期的细胞,调整细胞浓度为2.5×107/mL,按100μL/只进行臀部皮下注射。左臀部：阴性对照组（CNE-2/NC）,右臀部：干扰组（CNE-2/2224）。每组4只。在2周内每隔2天测量瘤体的长径、短径,观察瘤体体积大小变化。瘤体体积=短径2×长径/2。4、肝脏异位种植肺转移裸鼠模型每组5只裸鼠,10%水合氯醛100μL/只行腹腔内麻醉。取对数生长期的细胞,调整细胞浓度为5×107/mL,按50μL/只进行肝脏注射。其后继续在SPF条件下饲养。接种后2周处死裸鼠,打开腹腔,肉眼观察肝脏有无癌灶、肺脏有无转移灶,所有肝脏种植瘤及转移瘤均经病理切片HE染色,了解有无瘤体形成；并用Real Time RT-PCR、Western blot、免疫组化检测GnT-ⅤmRNA、蛋白表达水平有无改变；以及免疫组化检测E-cadherin及bcl-2的表达情况。（1） Real Time RT-PCR测定肝脏种植瘤中GnT-Ⅴ的mRNA表达情况用Trizol提取肝脏种植瘤组织总RNA,采用AMV逆转录合成cDNA. GnT-V上游引物为5’GAGCAGATCCTGGACCTCAG 3’,下游引物为5’GCTGTCATGACTCCAGCGTA 3’。使用β-actin作为内参,上游引物为5’GAAACTACCTTCAACTCCATC 3’下游引物为5’CGAGGCC AGGATGGAGCCGCC3’。反应条件为：95℃预变性3Os, PCR: 94℃5s, 60℃30s,共40个循环,溶解曲线：95℃0s,65℃60s,95℃0s.基于目的基因和看家基因实时荧光定量扩增曲线得到Ct（C为Cycle, t为threshold）值,△CT代表目的基因相对于内参基因的表达强度,公式为△CT=Ct目的基因-Ct内参基因。用Folds= 2-ΔΔCt表示实验组目的基因与对照组目的基因表达量的倍比关系,ΔΔCt=ΔCT实验组-△CT对照组。目的基因为GnT-Ⅴ,内参基因为β-actin。（2） Western blot检测GnT-Ⅴ蛋白表达提取肝脏种植瘤总蛋白,用测定蛋白浓度,吸取50μg总蛋白,去离子水补至20μL,加入等体积2×上样buffer煮沸7min,离心后吸取30μL上样,经不连续SDS-PAGE电泳分离后,用半干法电转移至PVDF膜上,5%脱脂奶粉37℃封闭2h, TBST洗膜后,将目的条带以及内参条带分别用羊抗人GnT-Ⅴ蛋白多克隆抗体（1：200）、鼠抗人GAPDH蛋白单克隆抗体（1：1000）4℃孵育过夜,洗膜后分别加入HRP标记的兔抗羊IgG （1:500）、HRP标记的羊抗鼠IgG（1：5000）,室温下摇动1h,洗膜后用ECL化学发光系统检测,暗室曝光X线片,冲洗胶片,UVI凝胶成像系统摄像,Image-Pro Plus 6.0软件分析条带灰度值,用GnT-Ⅴ/GAPDH代表GnT-Ⅴ的相对表达量。（3）HE染色取肝脏组织、肺脏组织块投入固定液中（10%福尔马林）,在低浓度到高浓度酒精中脱水,逐渐脱去组织块中的水份。再将组织块置于二甲苯中透明,浸蜡包埋。切片与贴片,脱蜡后用苏木精、伊红染色,脱水透明后树胶封固。（4）免疫组化石蜡切片脱蜡和水化后,对组织抗原进行相应的修复。切片加内源性过氧化物酶阻断剂,室温下孵育10分钟,加动物非免疫血清（兔／鼠）,室温下孵育20分钟。除去血清,每张切片加一滴一抗（GnT-Ⅴ蛋白多克隆抗体（1：200）、E-Caderin单克隆抗体（1：200）、Bcl-2单克隆抗体（1：300））,室温下孵育60分钟。切片加生物素标记的兔抗羊IgG,室温下孵育10分钟。除去PBS液,每张切片加链霉菌抗生素蛋白—过氧化酶,室温下孵育10分钟。冲洗后滴新鲜配制的DAB溶液,显微镜下观察。自来水冲洗,苏木素复染。（5）生存分析每组取8只裸鼠,建立肝脏异位种植肺转移裸鼠模型（具体方法同前）,记录每只裸鼠的生存天数。6、统计学分析实验结果均经SPSS13.0软件统计。计量资料统计分析结果用（X±S）表示,两组肝脏种植瘤瘤体组织中GnT-ⅤmRNA和蛋白水平均采用两独立样本t检验；皮下成瘤试验瘤体体积采用重复测量的方差分析,组内比较采用one-way ANOVA分析,组内的多重比较采用LSD法,两组间的比较采用两独立样本t检验；两组生存时间的比较采用Kaplan-Merer法分析。以P<0.05表示有统计学意义。四、结果1、皮下成瘤试验显示,4天后可见2组裸鼠皮下均有瘤体形成,随着时间延长,皮下瘤体不断增大（F=528.871,P=0.000）,两组的平均体积分别是85.204mm3、139.860mm3, CNE-2 GnT-Ⅴ/2224组细胞形成瘤体体积小于CNE-2 GnT-Ⅴ/NC组,体积数据及曲线均显示CNE-2 GnT-Ⅴ/2224组瘤体体积增大的速度较CNE-2 GnT-Ⅴ/NC组慢。与CNE-2 GnT-Ⅴ/NC组相比,CNE-2 GnT-Ⅴ/2224组的平均抑瘤率为24.0%。2、在第14天处死裸鼠时,CNE-2 GnT-Ⅴ/NC组裸鼠的肝脏肉眼可见长径为0.5～1.0cm的灰白色种植瘤,其中1只出现肝脏溶解性改变；而CNE-2 GnT-Ⅴ/2224组肉眼未见明显的种植瘤。HE染色证明两组裸鼠肝脏种植瘤处均有肿瘤细胞。2组裸鼠的肺脏,肉眼均未见明显转移结节,但在CNE-2 GnT-Ⅴ/NC组均出现大量胸腔积血。HE染色结果显示：CNE-2 GnT-Ⅴ/NC组可见肿瘤细胞,而CNE-2 GnT-Ⅴ/2224组未见明显的肿瘤细胞。两组的GnT-Ⅴ在mRNA、蛋白水平上均有显著性差异（t=43.873, P=0.001;t=70.838, P=0.000）。实验组mRNA水平的平均抑制率为68.3%,蛋白水平的平均抑制率为63.7%。3、肝脏种植瘤免疫组化显示：Bcl-2蛋白表达于细胞浆,CNE-2 GnT-Ⅴ/NC组Bcl-2蛋白表达量较CNE-2 GnT-Ⅴ/2224组强,E-钙粘蛋白表达与细胞膜,2组在表达量上无明显差异。4、CNE-2 GnT-Ⅴ/NC组与CNE-2 GnT-Ⅴ/2224组的中位生存时间分别是18天,19天,二组在统计学上无显著性差异（x2=0.191,P=0.662）。五、结论1、沉默鼻咽癌细胞株CNE-2中GnT-Ⅴ基因后,在体内种植瘤中GnT-Ⅴ的mRNA和蛋白表达显著降低。2、沉默CNE-2中GnT-Ⅴ基因,细胞在体内增殖能力受到抑制。3、沉默CNE-2中GnT-Ⅴ基因,体内肺转移能力受到抑制,裸鼠中位生存时间相对延长。4、沉默CNE-2中GnT-Ⅴ基因,细胞在体内的bcl-2表达水平下降,而E-cadherin未见明显改变。5、GnT-Ⅴ可能成为治疗鼻咽癌的有效靶点。