研究背景:视网膜变性疾病(Retinal degeneration,RD)是一类由遗传、光损伤、老化等多种原因导致的致盲性眼病,这类疾病以感光细胞变性和进行性丢失为共同的病理特征。其中感光细胞变性可引起视觉信息传入降低,进一步导致视网膜各级神经元以及胶质细胞结构和功能改变,进而触发包括外层视网膜和内层视网膜在内的整个视网膜重塑反应。视网膜重塑,尤其是内层视网膜重塑是目前大部分治疗措施疗效有限的重要原因。内层视网膜重塑与视网膜变性起始因素无关,主要是内层视网膜丧失外层视网膜信号传入后的代偿反应。在视网膜变性早期通过调控外层视网膜重塑维持外层视网膜信息传入的稳定,对于抑制内层视网膜重塑和治疗视网膜变性疾病具有重要意义。外层视网膜包括感光细胞层(视网膜下腔(Subretinal space,SRS)和外核层(Outer nuclear layer,ONL))和外丛状层(Outer plexiform layer,OPL)。感光细胞层的视杆细胞和视锥细胞感知光刺激,将光刺激转换为电信号,并通过OPL的突触结构将这些反应传递到内层视网膜。在视网膜变性疾病中,感光细胞变性是引起外层视网膜重塑的关键诱因。大部分致病因素首先导致视杆细胞出现原发性变性,而视锥细胞的继发性变性一般都出现在大量视杆细胞凋亡后。感光细胞变性和丢失是外层视网膜重塑过程中最重要的病理改变。在视网膜变性早期,感光细胞变性会导致感光细胞突起和双极细胞树突回退,同时引起突触蛋白丢失和异位。双极细胞在突触丢失,树突回退后,还可以重新长出突起伸入到感光细胞层寻找新的信息传入,形成异位突触。因此OPL突触重塑在维持外层视网膜向内层视网膜传递信息过程中发挥了重要作用。小胶质细胞(Microglia)作为中枢神经系统(Central nervous system,CNS)唯一固有免疫细胞,在神经系统发育和疾病过程中发挥着重要作用。视网膜变性时,内层视网膜小胶质细胞逐渐向外层迁移,并不断增殖、激活,最后大量聚集在感光细胞层。感光细胞层小胶质细胞是影响感光细胞变性和丢失的重要因素,但是其作用及机制尚存争议。其中很重要的原因是不清楚感光细胞层小胶质细胞的激活途径和激活小胶质细胞的类型。最近通过单细胞测序技术,在神经退行性疾病中如阿尔茨海默病(Alzheimer Disease,AD)发现了一类具有相似基因表达谱和功能的小胶质细胞亚群——疾病相关型小胶质细胞(Disease-associated microglia,DAM)。在DAM激活的过程中,小胶质细胞首先下调一些静息态的特征性基因,然后逐渐上调与溶酶体、吞噬功能、脂质代谢等功能相关的基因。在刚出生的小鼠视网膜发育过程中,程序性死亡的视网膜细胞同样可以诱导小胶质细胞激活为DAM以清除死亡细胞,维持正常的发育过程。因此我们推测视网膜变性过程中凋亡的感光细胞也可能促进感光细胞层小胶质细胞激活为DAM,然而目前对变性视网膜中DAM的激活及其对感光细胞变性、丢失的影响及机制尚不清楚。在CNS中,突触修剪是小胶质细胞重要功能,可以维持神经环路正常信息传递。在CNS发育和损伤修复过程中,小胶质细胞伸出突起通过补体信号通路识别和吞噬突触成分,以修剪功能异常的突触。在AD早期,静息态小胶质细胞通过补体途径识别和吞噬突触蛋白加速了变性神经元之间突触丢失。而抑制补体通路减少小胶质细胞对突触的修剪,可以有效的缓解AD模型早期认知功能的降低。RD和AD都属于神经退行性病变,神经元或者感光细胞进行性丢失是其共同病理特征;在两种疾病模型病变早期均可以观察到突触传递的异常。因此我们推测视网膜变性早期小胶质细胞通过突触修剪调控OPL突触重塑过程,但OPL小胶质细胞修剪感光细胞与双极细胞间突触的方式以及机制还有待进一步研究。研究假设:本研究假设:皇家外科学院(Royal College of Surgeons,RCS)大鼠变性过程中,感光细胞层小胶质细胞通过激活为DAM调控感光细胞变性,OPL小胶质细胞通过修剪突触调节感光细胞与双极细胞间的突触重塑,进而在外层视网膜重塑过程中发挥关键作用。研究方法与结果:本研究分为四个部分:第一部分RCS大鼠视网膜变性过程中外层视网膜重塑反应的特征1、RCS大鼠感光细胞变性的特点。TUNEL染色结果显示RCS大鼠感光细胞在P20时就出现明显的凋亡并进行性增加,到P50时残存的感光细胞仅为对照组的35.26%。通过Arrestin染色发现RCS大鼠视锥细胞的变化主要出现在P40后。以上结果表明,RCS大鼠外层视网膜在P15-P50时出现大量感光细胞变性、凋亡和丢失,其中视锥细胞变性晚于视杆细胞。2、RCS大鼠OPL突触重塑的特点。通过激光共聚焦成像以及共定位分析发现RCS大鼠OPL中感光细胞突触前膜的CtBP2和双极细胞突触后膜的mGluR6以及两者共定位的数量在P20就出现明显下降,P30时下降速度达到高峰,P50时数量下降了70%-90%。其中视锥突触的变化主要出现在P40后。通过PCR检测发现RCS大鼠视网膜CtBP2和mGluR6基因表达水平在P15-P50并没有显著降低。透射电镜结果显示RCS大鼠OPL视杆突触三联体结构在P15后开始解体。以上结果提示,以突触结构解体和突触蛋白丢失为主要变化的OPL突触重塑是RCS大鼠外层视网膜重塑反应的重要特征。第二部分RCS大鼠视网膜变性过程中外层视网膜小胶质细胞变化的特征1、RCS大鼠外层视网膜小胶质细胞数量和形态的变化特征。使用IBA1染色及全视网膜细胞计数分析发现,P15-P50时RCS大鼠视网膜小胶质细胞数量和形态的改变主要发生在外层视网膜。RCS大鼠OPL小胶质数量从P15开始首先出现增加,P30时达到峰值,随后又逐渐下降。而变性视网膜小胶质细胞在P20后才向感光细胞层迁移,到P50时感光细胞层(SRS和ONL)小胶质细胞数量占整个视网膜小胶质细胞总数的74.21%。2、RCS大鼠感光细胞层小胶质细胞的特性。通过全视网膜转录组测序以及PCR技术我们发现RCS大鼠视网膜中DAM相关基因的表达明显上调。通过使用Axl染色标记不同类型的小胶质细胞,我们观察到DAM的激活主要发生在RCS大鼠感光细胞层。通过CD45染色发现只有极少数来源于单核细胞的巨噬细胞分布于SRS靠近RPE细胞侧。以上结果表明,RCS大鼠视网膜变性促进感光细胞层小胶质细胞激活为DAM。3、RCS大鼠OPL小胶质细胞的特性。通过共聚焦高分辨成像技术以及形态学评分,我们发现RCS大鼠OPL小胶质细胞主要为静息态。但其中89.43%的小胶质细胞伸出突起与突触蛋白形成直接接触。另外RCS大鼠OPL小胶质细胞CD68的表达量逐渐增加。以上结果提示,RCS大鼠变性过程中OPL静息态小胶质细胞伸出突起与突触形成直接联系,同时增强了吞噬功能。第三部分RCS大鼠视网膜变性过程中小胶质细胞对外层视网膜重塑的作用1、集落刺激因子1受体(Colony-Stimulating Factor 1 Receptor,CSF1R)阻断剂对RCS大鼠视网膜小胶质细胞的清除效果。从P15开始持续喂食大鼠含有CSF1R阻断剂PLX3397的饲料,并分析不同浓度的药物对视网膜小胶质细胞数量的影响。结果显示300ppm(每1kg饲料中含有300mg药物)的PLX3397对RCS大鼠视网膜小胶质细胞的清除效果显著低于600ppm,但1200ppm和600ppm清除效果并没有差异。而且600ppm的PLX3397就可以完全清除对照组视网膜中的小胶质细胞。从P15喂食600ppm的PLX3397到P50可以清除RCS大鼠视网膜中63.22%的小胶质细胞,而80%残存的小胶质细胞分布于感光细胞层。因此在后续实验中我们从大鼠P15开始喂食600ppm的PLX3397清除视网膜小胶质细胞,用于小胶质细胞功能研究。2、清除小胶质细胞对RCS大鼠视网膜功能的影响。采用暗适应闪光视网膜电图(Flash Electroretinogram,FERG)以及光栅视动反应评估清除小胶质细胞对视网膜功能的影响。在正常大鼠中使用PLX3397清除小胶质细胞并不影响视网膜功能。在RCS大鼠中,清除小胶质细胞到P20和P30同样不影响视网膜功能;但清除小胶质细胞到P40首先引起暗适应FERG的b波幅值以及b/a比值的降低;清除小胶质细胞到P50导致暗适应FERG的a波、b波幅值以及视敏度均出现下降。以上结果表明,长时间持续使用CSF1R阻断剂清除RCS大鼠视网膜小胶质细胞加重了感光细胞和双极细胞功能损害,抑制了感光细胞与双极细胞之间的信息传递。3、清除小胶质细胞对RCS大鼠感光细胞变性的影响。采用TUNEL染色发现使用PLX3397清除小胶质细胞后RCS大鼠ONL凋亡细胞核显著增加,但存活的感光细胞核的数量只有到P50才出现明显的下降。Arrestin染色以及明适应FEGR结果显示只有清除小胶质细胞到P50才会加重视锥细胞的继发性变性。采用全视网膜转录组分析进一步发现清除小胶质细胞到P50抑制了感光细胞功能和结构相关基因的表达。以上结果提示,清除RCS大鼠视网膜小胶质细胞主要加重了感光细胞,尤其是视锥细胞的继发性变性。4、清除小胶质细胞对RCS大鼠OPL突触重塑的影响。CtBP2和mGluR6染色结果显示清除小胶质细胞到P30和P40主要增加了RCS大鼠OPL突触后游离的mGluR6的数量。PCR结果发现清除小胶质细胞到P30并不影响视网膜CtBP2和mGluR6基因的表达。以上结果表明,清除小胶质细胞减少了视杆双极细胞游离的突触后蛋白的丢失。5、清除小胶质细胞对RCS大鼠视杆双极细胞异常突起形成的影响。蛋白激酶C-α(Protein kinase C alpha,PKCα)染色结果显示清除小胶质细胞并不影响正常视网膜OPL突触以及视杆双极细胞形态。在RCS大鼠中,清除小胶质细胞增加了异常突起的数量以及长度,但并不改变异常突起表达mGluR6的比率。以上结果提示,清除小胶质细胞促进了视杆双极细胞异常突起的形成。第四部分RCS大鼠变性过程中小胶质细胞调控外层视网膜重塑反应的机制1、RCS大鼠视网膜变性过程中小胶质细胞调控感光细胞变性的机制。采用免疫荧光染色及流式细胞分析术发现使用CSF1R阻断剂到P50主要清除RCS大鼠感光细胞层的DAM,并不影响中间型小胶质细胞的数量和增殖能力。感光细胞层小胶质细胞在激活为DAM的过程中,主要吞噬凋亡的细胞及其碎片,与应激态的视锥细胞并没有直接接触。流式细胞数术结果显示P50的RCS大鼠视网膜中中性粒细胞、自然杀伤(Natural Killer,NK)细胞以及CD4阳性的T细胞数量明显增加,但清除小胶质细胞只会进一步加重中性粒细胞的浸润。浸润的中性粒细胞分布在感光细胞层,可以产生大量有害物质。小胶质细胞可以通过吞噬中性粒细胞和抑制Müller细胞分泌CXCL1趋化因子减少RCS大鼠视网膜中性粒细胞的数量。以上结果表明,RCS大鼠视网膜感光细胞层DAM可以通过清除死亡的感光细胞及其碎片和抑制中性粒细胞的浸润改善微环境,这可能是DAM延缓感光细胞继发性变性的主要机制。2、RCS大鼠视网膜变性过程中小胶质细胞调控OPL突触重塑的机制。免疫荧光染色及图像三维重建结果显示RCS大鼠OPL小胶质细胞主要吞噬和消化视杆双极细胞树突上游离的突触后mGluR6。通过观察补体分子在OPL的表达发现补体分子C1q和C3大量沉积在RCS大鼠OPL,并结合游离的mGluR6。以上结果表明,RCS大鼠OPL小胶质细胞通过补体途径识别和吞噬视杆双极细胞游离的突触后结构调控突触重塑。研究结论:1、本研究首次证实了RCS大鼠视网膜变性能够促进感光细胞层小胶质细胞先转化为中间型,再完全激活为DAM。并首次发现中间型小胶质细胞的增殖和存活并不依赖CSF1R信号通路。2、本研究首次阐述了RCS大鼠感光细胞层DAM的激活主要延缓感光细胞尤其是视锥细胞的继发性变性,并不影响视杆细胞的原发性变性。感光细胞层DAM能够通过清除凋亡细胞及其碎片和抑制中性粒细胞的浸润改善变性视网膜微环境,这可能是DAM抑制感光细胞继发性变性的主要机制。3、本课题率先报道了小胶质细胞通过修剪突触调控感光细胞与双极细胞间的突触重塑。RCS大鼠OPL小胶质细胞主要为静息态,这些小胶质细胞伸出突起通过补体途径识别和吞噬视杆双极细胞树突上游离的突触后结构。这有利于维持视杆双极细胞功能的稳定,延缓视杆双极细胞异常突起的形成。4、本研究揭示了小胶质细胞是影响RCS大鼠外层视网膜重塑反应的关键因素。创新性地使用CSF1R阻断剂清除RCS大鼠视网膜小胶质细胞,明确了小胶质细胞对感光细胞变性和OPL突触重塑的作用及其机制;为延缓感光细胞变性,延长感光细胞存活时间,抑制视网膜重塑、改善视网膜功能提供了新的思路和作用靶点。