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食源性病原菌能够引起人和动物的感染,是食品安全的主要问题之一。在动物养殖中抗生素的大量使用,导致细菌耐药率的不断提高,同时耐药基因能在细菌之间水平转移,给畜禽肉产品产业链构成巨大威胁。由于我国冷鲜鸡产业发展比较缓慢,生产技术比较落后,从而导致冷鲜鸡在生产运输和销售环节容易受到微生物的污染,因此对市售冷鲜鸡微生物污染情况进行评估,同时分析冷鲜鸡源大肠杆菌耐药性情况,具有重要现实意义。本研究以浙江省六个地区的市售冷鲜鸡为原料,对不同的来源的市售冷鲜鸡进行微生物检测,并对检出的大肠杆菌进行耐药性分析。研究主要分为三个部分:首先,对来自浙江省六个市的市售冷鲜鸡检测微生物污染指标,评估冷鲜鸡微生物污染水平;其次,对市售冷鲜鸡进行大肠杆菌分离,同时检测大肠杆菌耐药表型、耐药基因和毒力基因;最后选择13株具有代表性的大肠杆菌进行全基因组测序,预测所有的耐药基因、血清型和质粒,并对所测序的13株大肠杆菌进行多位点序列分型。(1)本研究共采集129只来自于浙江省六个地区(宁波、杭州、绍兴、湖州、嘉兴和金华)的农贸市场和超市地区的冷鲜鸡,其中超市冷鲜鸡55只,农贸市场冷鲜鸡74只。按照国标的方法分别检测菌落总数、大肠菌群、霉菌和酵母指标。结果表明菌落总数污染在105~108(CFU/g)数量级,菌落总数污染水平从小到大依次为绍兴、宁波、杭州、湖州、金华和嘉兴;其中5~6月份,农贸市场和超市菌落总数污染没有显著差异,7~8月份二者具有显著性差异;大肠菌群污染水平平均值在8.52×104MPN/g以上;酵母污染水平在103~105(CFU/g)数量级,高于霉菌污染,农贸市场和超市的霉菌和酵母污染没有差异;(2)本研究共检出133株大肠杆菌菌株。对分离大肠杆菌进行耐药表型、耐药基因和毒力基因的检测。冷鲜鸡大肠杆菌检出率表明,农贸市场检出率从大到小依次为金华(100%)、宁波(78.6%)、绍兴(54.5%),湖州(54.5%)、嘉兴(41.2%)和杭州(40%);超市大肠杆菌检出率从大到小依次为金华(92.9%)、宁波(75%)、嘉兴(71.4%)、绍兴(50%)、杭州(33.3%)和湖州(30.8%)。大肠杆菌耐药表型检测结果表明,大肠杆菌对氨苄西林的耐药率最高,其次为复方磺胺甲噁唑,耐药率分别为63.85%和55.39%,其次是头孢唑啉(30%)、头孢曲松(26.16%)、氨曲南(15.39%)、环丙沙星(23.85%)、左氧氟沙星(16.93)和庆大霉素(14.62%);哌拉西林、厄他培南和替加环素没有检出耐药性;通过来自农贸市场和超市的大肠杆菌对不同抗生素的耐药情况对比,两个来源的大肠杆菌对氨苄西林和复方磺胺甲恶唑的耐药率都在50%以上,对其他药物的耐药率均低于40%。大肠杆菌多重耐药性情况表明,耐3种以上抗生素的大肠杆菌菌株占36.1%,4株大肠杆菌最多可耐6类抗生素,分别是青霉素类、头孢类、氨基糖苷类、喹诺酮类、四环素类和磺胺类抗生素。(3)大肠杆菌耐药基因检测结果显示,喹诺酮耐药基因qnrS、aac(6’)-Ib、oqxA和oqxB耐药基因检出率分别为56.4%、33.8%、25.6%和17.3%;超广谱β-内酰胺酶(ESBL)与头孢类耐药基因TEM、CTX-M-2、CTX-M-9和CTX-M-1检出率分别为41.4%、37.6%、27.8%和13.5%;β-内酰胺类耐药基因ompCA和ompFA检出率分别为75.2%和57.1%;氨基糖苷类耐药基因aphA30、aadA和aacC2检出率分别为63.2%、47.4%和16.5%;四环素类耐药基因tetC、tetM、tet X、tetG和tetO检出率分别为9%、3.6%、4.5%、3%和2.6%;磺胺类耐药基因sulⅠ和sulⅡ检出率较高,分别为77.4%和87.2%;大肠杆菌毒力基因检测结果表明:肠致病性大肠杆菌(EPEC)毒力基因eae和产志贺毒素大肠杆菌(STEC)stx基因未检出;其他四种毒力基因est、elt、ipaH和aggR基因检出率在10%左右(4)通过对13株大肠杆菌全基因组测序,并进行结果分析。其中12株大肠杆菌分别预测到不同的耐药基因,包含氨基糖苷类耐药基因、β-内酰胺类耐药基因、四环素类耐药基因、甲氧苄啶耐药基因和磺胺类耐药基因;9株大肠杆菌可以预测到不同的质粒,并能够与肠杆菌科质粒相匹配,其中6株大肠杆菌质粒类型能够与耐药基因的复制子相匹配,进一步验证携带耐药基因的质粒在耐药性传播有重要的作用。13株大肠杆菌共预测到O血清型10种,H血清型9种,其中O174、O9和H4、H10血清型出现2~3次,各个地区来源的大肠杆菌血清型具有较大的差异性。根据7个管家基因对13株大肠杆菌进行MLST分型,结果表明,杭州、湖州和绍兴的大肠杆菌亲缘关系较近,归为一簇,宁波和金华的大肠杆菌亲缘关系较近,嘉兴的大肠杆菌单独成一簇。