研究目的肌卫星细胞和成肌细胞增殖与分化在骨骼肌肥大中发挥重要作用,对肌卫星细胞/成肌细胞体外施加周期性机械牵拉常被用于模拟运动对骨骼肌肥大的研究。我们前期的研究发现,雄激素受体(androgen receptor,AR)在15%牵拉促进、20%牵拉抑制C2C12成肌细胞增殖中可能起重要作用。本文在前期研究的基础上,先用AR特异性拮抗剂氟他胺证实AR在牵拉调控C2C12细胞增殖中的作用。然后比较15%和20%牵拉对L6(无AR表达)和C2C12(有AR表达)成肌细胞增殖调控的差异,并用AR过表达质粒转染L6细胞来证实AR在15%和20%牵拉调控成肌细胞增殖中的作用。已证实AR对肌肉蛋白质合成的促进作用与其激活胰岛素样生长因子-1(IGF-1)/IGF-1受体(IGF-1R)-磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)密切相关,但AR在运动或牵拉调控成肌细胞增殖中的作用是否也与上述信号通路有关仍不明确。因此,本研究利用IGF-1中和性抗体、IGF-1重组多肽,以及PI3K/Akt和MAPKs(p38和ERK1/2)抑制剂,研究AR在牵拉调控成肌细胞增殖中的作用机制:是否通过激活IGF-1/IGF-1R-PI3K/Akt和MAPKs(p38和ERK1/2)实现?此外,本研究还检测了15%和20%周期性机械牵拉对C2C12和L6成肌细胞分化的影响,初步探索AR在牵拉调控成肌细胞分化中的作用。本研究为机械牵拉调控成肌细胞增殖和分化提供新的理论解释,也为适度运动增加、过度运动降低骨骼肌质量和力量提供新的理论支持。研究方法1.利用Flexcell-5000T细胞牵拉装置对C2C12和L6细胞施加15%或20%周期性机械牵拉(频率0.5 Hz,持续6 h)。2.研究AR在牵拉调控成肌细胞增殖中的作用,包括以下研究:(1)不同浓度的AR拮抗剂氟他胺(Flutamide,20μM、40μM和60μM)是否减弱15%牵拉对C2C12成肌细胞的促增殖(CCK8法)作用?(2)15%和20%牵拉对L6成肌细胞(无AR表达)增殖的影响,并与相同牵拉条件下的C2C12细胞(有AR表达)做比较;(3)外源转入AR对15%和20%牵拉的L6细胞增殖的影响。3.研究AR在牵拉调控成肌细胞增殖中发挥作用的机制,包括以下研究:(1)15%和20%牵拉对L6细胞IGF-1分泌(ELISA)、IGF-1R蛋白表达(Western blot),以及PI3K/Akt和MAPKs(p38和ERK1/2)蛋白水平和活性(Western blot)的影响,并与相同牵拉条件下的C2C12细胞作比较;(2)IGF-1中和性抗体对15%牵拉的C2C12细胞、IGF-1重组多肽对牵拉L6细胞的增殖以及PI3K/Akt、p38和ERK1/2活性的影响;(3)PI3K/Akt、p38和ERK1/2的特异性抑制剂对15%牵拉的C2C12和L6细胞增殖的影响;(4)外源转入AR对牵拉的L6细胞上述指标的影响。4.研究AR在15%和20%牵拉调控成肌细胞分化中的作用。在C2C12和L6成肌细胞做以下研究:(1)15%和20%牵拉结束后第1、3、5 d,观察是否形成肌管(光学显镜),判断分化是否延迟,并比较两细胞间的差异;(2)牵拉结束后第7 d,检测两细胞间形成肌管数量和直径的差异(MHC免疫荧光)。研究结果1.AR在15%和20%周期性机械牵拉调控成肌细胞的增殖中的作用1)与15%牵拉组相比,AR特异性拮抗剂Flutamide以剂量依赖的方式降低15%牵拉对C2C12细胞的促增殖作用。2)未牵拉状态下,L6成肌细胞增殖速率低于C2C12细胞,而外源转入AR可促进L6成肌细胞的增殖。3)与C2C12细胞类似,15%牵拉促进、20%牵拉抑制L6成肌细胞增殖。但牵拉对C2C12和L6细胞增殖的调控幅度不同,表现为15%牵拉对L6细胞的促增殖作用显著低于C2C12细胞(约是后者1/3),20%牵拉对L6细胞的抑增殖作用明显高于C2C12细胞(约是后者的2倍)。4)外源性转入AR可进一步增强15%牵拉对L6细胞的促增殖作用,以及逆转20%牵拉对L6细胞的抑增殖作用。以上结果证实了AR在15%和20%周期性机械牵拉调控成肌细胞增殖中起重要作用。2.AR在15%和20%周期性机械牵拉调控成肌细胞增殖中的作用机制1)IGF-1/IGF-1R在牵拉调控成肌细胞增殖中的作用,及其对PI3K、p38和ERK1/2活性的调控a.15%牵拉增加、20%牵拉减少C2C12细胞的IGF-1分泌量及IGF-1R蛋白水平(前期研究结果)。本研究发现,L6细胞无论是在安静状态,还是15%和20%的牵拉状态均未检测到IGF-1分泌,但15%牵拉提高、20%牵拉降低L6细胞IGF-1R蛋白水平。b.IGF-1中和抗体不仅抑制15%牵拉的C2C12细胞增殖,还以剂量依赖方式降低15%牵拉的C2C12细胞PI3K、p38和ERK1/2活性。c.外源性IGF-1重组多肽在提高15%牵拉对L6细胞的促增殖作用、逆转20%牵拉抑增殖作用的同时,还增加IGF-1R蛋白水平以及提高PI3K/Akt、p38和ERK1/2的活性。2)PI3K和MAPKs(p38和ERK1/2)在牵拉调控成肌细胞增殖中的作用a.15%牵拉提高、20%牵拉降低C2C12细胞的PI3K/Akt、p38以及ERK1/2活性;且加入PI3K/Akt、p38和ERK1/2的抑制剂能降低15%牵拉对C2C12细胞的促增殖作用(前期研究结果)。b.15%和20%牵拉对C2C12和L6细胞PI3K/Akt、p38以及ERK1/2活性的调控幅度存在差异,表现为:(1)15%牵拉对L6细胞的p38活性无影响,但提高C2C12细胞p38的活性达3倍以上;对L6细胞ERK1/2活性的提高幅度约是C2C12细胞的一半;对于PI3K活性的影响,两细胞间无差异。(2)20%牵拉对L6细胞p38活性的抑制作用约是C2C12细胞的6.7倍;对PI3K和ERK1/2活性的抑制作用,两细胞间无差异。c.PI3K和ERK1/2抑制剂、而非p38抑制剂,能阻断15%牵拉对L6细胞促增殖作用。3)AR对IGF-1/IGF-1R,以及PI3K、p38和ERK1/2的调控a.外源转入AR到L6细胞,在增强15%牵拉促增殖、逆转20%牵拉抑增殖作用的同时,伴随着受牵拉L6细胞IGF-1R蛋白表达水平的增加,尽管仍未检测到IGF-1分泌。b.外源转入AR到L6细胞,还可提高受牵拉L6细胞PI3K/Akt、p38和ERK1/2的活性。以上结果表明,AR在15%和20%牵拉调控成肌细胞增殖中的作用是通过IGF-1/IGF-1R的介导,进而激活p38和ERK1/2活性(15%牵拉)或抑制p38活性(20%牵拉)实现。3.AR在周期性机械牵拉调控成肌细胞分化中的作用1)周期性机械牵拉对C2C12和L6成肌细胞分化(分化延迟、形成的肌管数量和直径)的影响与安静对照组相比,15%和20%牵拉对C2C12和L6成肌细胞分化形成肌管的时间、肌管直径均没有影响。但是15%牵拉增加、20%牵拉减少C2C12和L6细胞分化形成肌管的数量。2)AR在周期性机械牵拉调控成肌细胞分化中的作用对于分化的C2C12和L6细胞,15%牵拉增加、20%牵拉减少肌管数量的程度不同。15%牵拉增加分化L6细胞的肌管数量比C2C12细胞的少,而20%牵拉减少L6细胞的肌管数量要高于C2C12细胞。以上结果提示AR在牵拉调控成肌细胞分化中起作用,体现在影响肌管数量。研究结论1.15%牵拉促进C2C12和L6这两种成肌细胞增殖,而20%牵拉抑制它们增殖,表明机械牵拉对成肌细胞增殖的调控具有普遍性,但调控幅度在两细胞间存在明显差异。2.AR在15%和20%周期性机械牵拉调控C2C12成肌细胞增殖中起重要作用。即使在没有AR表达的L6成肌细胞,外源转入AR也能增强牵拉L6细胞的增殖。3.AR在15%牵拉促增殖中的作用是通过促进IGF-1分泌、增加IGF-1R水平,进而激活p38和ERK1/2的活性实现;而AR在20%牵拉抑制增殖中的作用则通过抑制IGF-1/IGF-1R-p38通路实现。4.15%牵拉增加、20%牵拉减少分化C2C12和L6成肌细胞形成肌管的数量,但两细胞间存在明显差异,提示AR在周期性机械牵拉调控成肌细胞分化中起作用。