目的:巨噬细胞的增殖和迁移在血管内皮损伤诱发的内膜增生中发挥重要作用,因此,有效抑制巨噬细胞增殖和迁移对预治以血管内膜增生为特征的血管重构性疾病具有重要意义。Krüppel-like factor 5(KLF5)是具有锌指结构多功能转录因子,在心血管、癌症等多种疾病中参与细胞增殖、迁移和凋亡的调控,然而,目前KLF5在巨噬细胞增殖和迁移中的作用及机制尚不十分清楚。通心络(Tongxinluo,TXL)是根据络病理论研制的中药复方提取物,因其具有良好的血管保护作用,故临床上广泛应用于心脑血管疾病的治疗。近年虽然对通心络保护血管的作用机制进行了大量研究,但其抑制血管重构与KLF5表达及巨噬细胞增殖、迁移之间的关系尚有待阐明。本研究旨在探讨KLF5在通心络抑制巨噬细胞增殖、迁移及血管内膜增生中的作用及分子机制,诱导的巨噬细胞增殖的抑制作用及其分子机制,以期为通心络临床应用提供新的理论支持及实验依据。方法:KLF5wt和巨噬细胞敲除KLF5(KLF5ly-/-)小鼠随机分为对照组、颈动脉结扎组和颈动脉结扎+通心络治疗组,苏木精-伊红染色评价内膜增生的形态学变化。免疫荧光双重染色观察Mac-2、KLF5和PCNA表达活性与观察巨噬细胞浸润及血管内膜增生的关系。用TNF-α刺激体外培养的巨噬细胞RAW264.7,触发巨噬细胞炎症的炎症反应,同时给予通心络干预。Western bolt检测巨噬细胞中KLF5和PCNA的表达;伤口愈合(划痕)实验观察巨噬细胞的迁移能力;MTS测定巨噬细胞增殖活性。免疫共沉淀检测KLF5的苏素化/泛素化水平已及FBXW7与KLF5之间的相互作用及相关的信号通路。结果:1通心络通过抑制巨噬细胞增殖和迁移而减轻颈动脉结扎诱导的内膜增生将C57BL/6J小鼠随机分为对照组、颈动脉结扎组和颈动脉结扎+通心络治疗组。苏木精-伊红染色结果显示,与对照组(Con)相比,结扎组(Ligated)小鼠颈动脉内膜显著增生,其I/M比值明显增加;而颈动脉结扎+通心络(ligated+txl)组小鼠的动脉内膜增生明显少于结扎组。上述结果表明,通心络可以抑制颈动脉结扎诱导的血管内膜增生。伤口愈合实验显示,tnf-α组明显高于对照组,而通心络预孵育后,迁移进划痕区的细胞较tnf-α组明显减少,说明通心络能够抑制tnf-α诱导的raw264.7细胞的迁移。mts结果显示,tnf-α显著诱导巨噬细胞增殖,通心络预处理后再给予tnf-α刺激,巨噬细胞增殖较tnf-α组明显下降,提示通心络能够逆转tnf-α刺激引起的巨噬细胞的增殖。2通心络通过下调klf5表达而抑制tnf-α诱导的巨噬细胞增殖mac-2和klf5免疫双荧光染色的结果显示,颈动脉结扎组mac-2及klf5染色阳性细胞数较多,而颈动脉结扎+通心络组明显少于结扎组,提示通心络可能通过阻抑klf5的表达来抑制巨噬细胞的迁移与增殖。raw264.7细胞随机分为对照组、tnf-α组、通心络组(txl)、tnf-α+通心络组(tnf-α+txl)。westernbolt结果显示,通心络预处理显著下调pcna和klf5蛋白表达。3klf5介导巨噬细胞增殖、迁移和血管内膜增生苏木精-伊红染色结果显示,与转染空载体pad的小鼠相比,转染pad-klf5的小鼠血管内膜增生更为显著,内膜中膜比(i/m)值明显增大。通心络处理能逆转klf5过表达对血管内膜增生的促进作用。免疫荧光结果显示,与pad组相比,pad-klf5组的mac-2和pcna阳性染色细胞数明显增多,而在pad-klf5+通心络组,mac-2和pcna阳性染色细胞数量减少。苏木精-伊红染色结果显示,与野生型(klf5wt)小鼠相比,klf5ly-/-小鼠的血管内膜增生显著减少。免疫荧光结果显示,klf5ly-/-小鼠,mac-2和pcna阳性染色细胞数明显少于野生型(klf5wt)小鼠。以上结果提示,klf5介导巨噬细胞增殖、迁移和血管内膜增生,通心络通过下调klf5的表达抑制血管内膜增生。4通心络抑制klf5过表达诱导的巨噬细胞增殖和迁移westernblot结果显示,与pad组相比,klf5过表达显著促进raw264.7细胞对pcna的表达,通心络干预则逆转klf5过表达诱导的pcna表达上调。mts和伤口愈合实验结果显示,与pad组相比,klf5过表达显著促进巨噬细胞的增殖和迁移。用通心络预孵育raw264.7细胞24h后,再转染pad-klf5,巨噬细胞增殖和迁移受到显著抑制。以上结果说明,klf5过表达可以促进巨噬细胞的增殖和迁移,通心络通过阻抑klf5的表达而抑制巨噬细胞的增殖和迁移。5通心络通过pi3k/akt和nf-κb信号通路,调节klf5的苏素化和泛素化,进而促进klf5降解。为了进一步明确通心络抑制klf5表达的分子机制,我们用免疫共沉淀(coip)检测klf5在不同影响因素作用下的泛素化。结果显示,与对照组相比,tnf-α抑制klf5的泛素化,tnf-α+通心络孵育组的klf5泛素化水平显著增加,提示通心络通过促进klf5泛素化,进而加速klf5降解。westernblot结果显示,通心络既能够上调fbxw7蛋白的表达,也能促进klf5与fbxw7之间的相互作用。因为已知klf5的苏素化抑制klf5与fbxw7之间的相互作用,因此我们进一步观察tnf-α以及通心络对klf5苏素化的影响。免疫共沉淀(coip)结果显示,与对照组相比,在tnf-α处理的细胞中,klf5的苏素化水平显著升高,通心络干预使klf5苏素化水平下降。信号通路相关蛋白的检测发现,tnf-α可以上调p-akt和p-nf-κb水平,说明tnf-α能激活akt和nf-κb信号通路。用akt和nf-κb特异性的抑制剂处理raw264.7细胞后,westernblotting和免疫共沉淀(coip)结果显示,klf5的苏素化水平降低。这些结果表明,通心络通过激活pi3k/akt和nf-κb信号通路来阻抑klf5的苏素化,进而增加klf5与fbxw7的相互作用及klf5的泛素化,最终导致klf5的稳定性降低。结论:1通心络通过抑制巨噬细胞增殖和迁移而减轻颈动脉结扎诱导的内膜增生。2通心络通过下调klf5表达而抑制tnf-α诱导的巨噬细胞增殖。3klf5介导巨噬细胞增殖、迁移和血管内膜增生。4通心络抑制klf5过表达诱导的巨噬细胞增殖和迁移。5通心络通过pi3k/akt和nf-κb信号通路,调节klf5的苏素化和泛素化,进而促进klf5降解。