慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)是心血管疾病中高致死性疾病。高血压、心肌缺血(MI)、心律失常、药物(异丙肾上腺素,ISO)和其他常见的心血管疾病由于长期压力超负荷(PO)、心肌损伤和心肌收缩力的减弱等不同诱因,超出心脏的代偿能力,最终可导致心功能减弱,发展为慢性心力衰竭。目前,临床常用的CHF防治药物存在药物毒性大、治疗窗口窄、长期服用增加死亡率等严重不良反应。因此,寻求能够防治慢性心力衰竭的新结构、新靶点药物以及新的治疗途径具有重要的意义。内皮细胞分布于血管壁的表面,是整个心血管系统的重要功能单元。它不仅是血管的第一道屏障,而且本身也能释放生物活性物质,参与物质的交换,调节血管的紧张度和血管的生成。内皮细胞的完整性与心血管疾病关系密切,内皮功能紊乱可促进心血管疾病的发生;心血管疾病的发生发展可导致内皮功能的紊乱,加速疾病的发展,两者相辅相成。内皮功能紊乱主要表现为内皮细胞释放血管舒缩因子的失衡,如NO和内皮素。内皮功能紊乱在CHF病理过程起着关键的作用。文献报道,CHF病人伴有NO和内皮素失衡,NO是心血管重塑的重要调节剂,ET-1是心肌肥大和CHF重要的促进因子,两者长期失衡会促进心脏和血管重构,促进心力衰竭发展。因此,纠正内皮细胞分泌生物活性物质失衡,以恢复其正常功能是CHF全新的治疗策略。KATP通道(ATP sensitive potassium channel)广泛存在于各种组织器官中,但有明显的组织特异性,不同组织KATP通道的SUR和Kir两亚基组成不同亚型分布不同。血管主要分布的是SUR2B/Kir6.1和SUR2B/Kir6.2亚型,平滑肌细胞和内皮细胞SUR2B/Kir6.1的表达更为丰富。本中心前期研究证实,激活内皮细胞的SUR2B/Kir6.1通道,纠正内皮功能的失衡,是心血管疾病治疗的新作用靶点。Ipt是属于脂肪仲胺类KATP开放剂(KCOs),是拥有完全自主知识产权的全新结构化合物,目前Ipt对适应症高血压的治疗已进入III临床研究。Nat是Ipt的衍生物,其母核相同,侧链结构不同。我们前期利用细胞膜片钳技术发现,在正常的生理状态下Ipt和Nat能够高选择性激活SUR2B/Kir6.1通道;在细胞能量代谢受到抑制时,Ipt和Nat对SUR2B/Kir6.1通道的选择性更高,这些研究为脂肪仲胺类KCOs Ipt和Nat防治CHF研究提供了理论基础。针对心力衰竭发生的不同诱因,前期我们在PO-CHF模型分别观察了Ipt和Nat的药理学效果,分别在MICHF和ISO-CHF模型观察了Nat的效果,结果显示Ipt和Nat均可保护内皮功能,改善PO-CHF、MI-CHF和ISO-CHF血流动力学和心肌重塑等指标。在前期研究的基础上,本研究进一步证实靶向SUR2B/Kir6.1通道开放剂改善CHF的药理学证据,深入揭示新的分子机制。我们重点回答以下问题:(1)在相同的实验条件下,具有相同母核结构的同类化合物Nat和Ipt通过靶向SUR2B/Kir6.1通道抗CHF是否具有相同的药物效应;(2)在体内,KATP通道特异性阻断剂(KCB)格列本脲(Gli)是否可以阻断Nat的心血管效应;(3)KCOs与血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)赖诺普利(Lis)的防治CHF作用是否具有不同的机制;(4)基于SUR2B/Kir6.1通道激活,哪些蛋白分子调节通路涉及到Nat的防治CHF机制;(5)miRNAs作为心血管领域的热点调控分子,与CHF疾病发生密切相关,miRNA分子通过怎样的调控网络参与Nat的药理学作用。上述研究的目的旨在为靶向激活SUR2B/Kir6.1通道防治CHF新的治疗方法提供实验证据,为抗CHF创新药物研究开展提供新的研究方向。同时,对Nat防治CHF分子机制提供更新、更深入的了解。第一部分靶向SUR2B/Kir6.1通道的新型KCOs Nat对CHF的防治作用本研究在前期建立的模型基础上,我们设立9个组:空白对照组、ISO模型组、不同剂量Nat 1,3,9 mg·kg-1·d-1组、Ipt 3 mg·kg-1·d-1组,Lis 15 mg·kg-1·d-1组,Gli 50 mg·kg-1·d-1组和Gli联合Nat 3 mg·kg-1·d-1治疗组。我们比较了相同剂量(3mg·kg-1·d-1)Ipt和Nat在相同模型下的药理学效果;首次在体内实验中观察了KCB Gli对Nat治疗作用的影响;比较了ACEI Lis与Nat防治CHF作用机制。结果显示,在血流动力学方面,剂量1,3,9 mg·kg-1·d-1Nat能改善收缩期LVSP、+dp/dtmax、Vpm、Vmax和舒张期LVEDP、-dp/dtmax血流动力学指标;相同剂量(3mg·kg-1·d-1)Ipt和Nat具有相同的药理学作用;Gli能够拮抗Nat改善血流动力学的作用。在心脏结构重构方面,我们从心肌组织HE染色、透射电镜以及免疫组化观察发现,1,3,9 mg·kg-1·d-1 Nat能逆转心脏病理结构的改变,相同剂量(3mg·kg-1·d-1)Ipt也能逆转心肌病理性改变,Gli不影响ISO诱导的心肌重构,但能拮抗Nat逆转心脏病理性结构改变的作用。Lis能够逆转心肌结构病理性改变。相同剂量Nat和Ipt均能下调CHF生物标志物NT-pro BNP和BNP的含量,Gli能够阻断Nat的效果;Lis能够减少这两个生物标志物在血浆中的含量。在内皮保护机制研究方面,Nat能够升高心肌组织保护性e NOS m RNA的表达,下调心肌组织病理诱导型i NOS和ET-1m RNA的表达;相同剂量Ipt和Nat表现出相同药理学作用机制;Gli能够拮抗Nat改善NO和ET-1的作用。Lis能够下调血浆ET-1含量和心肌组织中ET-1 m RNA表达,对于e NOS和i NOS m RNA表达影响无统计学意义。这些结果说明,Nat和Ipt通过激活SUR2B/Kir6.1通道防治CHF与纠正NO和ET系统的失衡,恢复血管内皮细胞的功能相关。Lis能够改善CHF,但其药理学作用机制与Nat完全不同。第二部分基于i TRAQ技术分析靶向SUR2B/Kir6.1通道Nat防治CHF的分子机制为了深入揭示Nat的作用机制,我们选取与内皮密切相关的血浆作为研究对象,观察Nat治疗前后血浆蛋白组分的变化。我们运用i TRAQ技术寻找与Nat防治CHF密切相关的关键蛋白,结果我们鉴定出724个蛋白。与ISO模型组比较,有55个蛋白存在差异(P<0.05),其中有33个上调,22个下调,结果说明这55个蛋白与Nat作用密切相关。进一步通过生物信息学对55个蛋白进行GO分析与功能注释,KEGG pathway富集分析以及蛋白-蛋白相互作用。结果分析发现,GO富集分析可以将富集蛋白分为三类:参与生物学过程、具有分子功能和属于细胞组分,GO分析发现有42个蛋白被富集,如内皮发育(P=0.0230)和ATP分解过程(P=0.0024)。GO分析预示Nat改善CHF分子机制可能通过上述生物学过程或分子实现。KEGG pathway富集分析了其中的24条通路,富集到的蛋白通路包括PRKAR2β、GAS6/e NOS/NO和NO/PKG/VASP通路,这些通路与CHF改善密切相关。蛋白-蛋白相互作用网络主要分为四类:蛋白酶体系统功能,ATP能量代谢过程,应激和c AMP依赖的PKA信号通路,这些蛋白功能簇在CHF病理生理过程中起到关键作用。我们筛选出血浆中ATP和5个关键蛋白,ELISA验证结果与iTRAQ分析结果相一致。其中,PRKAR2β,GAS6和VASP差异蛋白涉及到Nat改善内皮机制,而ATP,TIMP3和AGT表达变化归于Nat的心血管作用。我们进一步建立细胞模型验证NO和VASP之间的关系,发现Nat能够显著上调关键蛋白VASP的表达,一氧化氮合酶(NOS)拮抗剂L-NAME能够抑制Nat对VASP的影响,揭示了靶向内皮细胞SUR2B/Kir6.1通道的Nat可通过e NOS/VASP途径治疗CHF的药理学新机制。第三部分miR-1-3p在Nat防治CHF中的作用及其分子途径micro RNA(miRNA或miR)具有最广泛的基因调节功能,miRNAs与心血管系统密切相关,许多miRNAs在血管和心脏中特异性的表达并发挥着关键的调节功能。基于在线数据库(NCBI和GO)和文献报道,我们选取了13个miRNAs进行研究,应用q RT-PCR技术检测心肌组织miRNAs表达水平,结果显示,经Nat治疗后心肌组织中miR-1-3p、miR-133a-3p和miR-29a-3p表达显著升高,miR-423-5p、miR-125a-5p、miR-125b-5p和miR-199a-3p表达下降。其中miR-1-3p表达差异倍数尤为显著。我们选取miR-1-3p作为研究对象,利用miRDB和Target Scan数据库预测其调控的靶基因,取两数据库预测到靶基因的交集,共得到183个靶基因;这些靶基因GO和KEGG富集分析结果发现,miR-1-3p调控许多靶基因,可以富集到与心血管疾病相关的生物学过程或信号通路,说明miR-1-3p调控网络在心血管系统中的调控作用。同时,靶点预测发现miR-1-3p与ET-1 m RNA 3’UTR 158-165序列间存在结合。为了验证其是否存在互补序列,我们成功构建靶基因ET-1 m RNA 3’UTR野生型和突变体双荧光素酶载体,与miR-1-3p mimic共转染HEK 293细胞,应用荧光法证实了两者之间存在结合。为了进一步说明Nat、miR-1-3p和ET之间的关系,我们成功构建miR-1-3p慢病毒过表达载体PDS087-pri-miRNA-1-3p和慢病毒抑制表达载体p L6.3-GFPTu D2-rno-miR-1-3,并成功进行了慢病毒的包装。在大鼠心肌微血管内皮细胞(RPCMEC)模型上,观察了Nat对miR-1-3p表达的影响,结果表明Nat可上调miR-1-3p的表达,与动物模型结果相一致;通过过表达和抑制表达miR-1-3p慢病毒感染RPCMEC,应用q RT-PCR和Western blot在基因和蛋白层面上证实了ET-1与miR-1-3p之间呈现反向表达。这些结果说明,Nat可通过miR-1-3p调节内皮细胞的ET-1表达,纠正内皮功能失衡达到改善CHF的药理学作用。综上,本研究可以得出以下结论:1.本研究在相同的动物模型和相同药物剂量条件下,比较了不同分子结构、相同作用靶标新型KCOs Nat和Ipt防治CHF的药理学效果,发现两者抗CHF作用效果显著,且等效剂量作用基本相同。其作用机制与纠正内皮功能紊乱,保护内皮相关。ACEI Lis不是通过纠正NO和ET系统的失衡改善CHF的,其作用机制与Nat完全不同。Gli可拮抗Nat的抗CHF作用,说明Nat的抗CHF的作用是通过靶向激活SUR2B/Kir6.1通道实现的。这些结果为同类KCOs通过SUR2B/Kir6.1通道治疗CHF的新途径提供了系统的药理学证据。2.本研究利用蛋白质组学方法筛选并验证了5个关键蛋白。生物信息学分析显示,Nat治疗后VASP与NO系统密切相关。体内和体外实验验证发现,Nat可通过内皮细胞e NOS/VASP途径改善NO和ET系统的失衡,达到防治CHF的作用,这一机制为Nat防治CHF药理学作用机制提供了新的见解。3.本研究在动物模型和细胞模型上发现miR-1-3p与Nat的作用相关。靶点预测和验证证实miR-1-3p和ET-1 3’UTR存在互补序列,提示两者之间存在互相调控作用。通过构建过表达和抑制表达miR-1-3p慢病毒感染细胞,证实Nat通过miR-1-3p/ET-1途径调节内皮系统功能进而抗CHF的分子机制,为Nat抗CHF作用机制提供了新的研究方向。总之,本文为新型KCOs Nat和Ipt通过靶向激活SUR2B/Kir6.1通道防治CHF新途径提供系统全面的药理学证据,这对于具有相同类型结构的新型KCOs防治CHF创新药物研发具有重要指导意义。同时,为揭示Nat防治CHF分子机制提供了深入的了解和新的研究方向。