猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF3、ORF5基因的克隆、核酸疫苗构建及实验免疫研究

来源 :沈阳农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:sarahfung
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本文根据已发表的PRRSV国内分离株BJ-4株的核苷酸序列,设计了两对引物,用RT-PCR的方法扩增了PRRSV长春分离株ORF5、ORF3两个重要的免疫原性基因,经凝胶电泳回收后克隆到pMD-18T载体上,酶切鉴定证实后进行序列测定。序列分析表明PRRSV长春分离株与标准美洲株的氨基酸同源性较高,ORF3基因氨基酸的同源性达92.4%,ORF5基因氨基酸的同源性达88.7%,表明PRRSV长春分离株属于美洲型。 将扩增后获得的PRRSV长春分离株ORF5、ORF3基因,克隆到真核表达载体pVAX1及pVIR-IL-18的启动子CMV下游,构建成真核表达质粒pVAX1-ORF5、pVAX1-ORF5-ORF3及含有猪白细胞介素IL-18的核酸疫苗pVIR-IL18-ORF5、pVIR-IL18-ORF5-ORF3。通过Western-blot以及IFA等检测方法确认,所构建的4个重组DNA疫苗质粒在真核细胞能进行有效的转录,并表达了目的蛋白(GP5)、(GP3)。 将所构建的4个重组DNA疫苗质粒进行了Balb/c小鼠免疫试验,检测了免疫后的ELISA抗体水平和脾T淋巴细胞亚群数量。结果表明:共表达猪IL-18基因的核酸疫苗pVIR-IL-18-ORF5、pVIR-IL18-ORF5-ORF3免疫后的ELISA抗体水平和脾T淋巴细胞亚群数量均优于pVAX1-ORF5,pVAX1-ORF5-ORF3。所构建的核酸疫苗体液免疫水平不如灭活苗理想,细胞免疫水平好于灭活苗说明所构建的核酸苗能够激发机体产生良好的细胞免疫水平。本研究为进一步研究PRRSV结构蛋白的结构和功能以及新型疫苗奠定了基础。
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