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目前,具有命名地位的原核生物的名录(List of Prokaryotic Names with Standing in Nomenclature,LPSN)正式确认的螺杆菌属有34种螺杆菌(2013年止)。幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)在人类感染比较普遍,主要引起人类的胃和十二指肠的炎症、溃疡及肿瘤;其他33种非幽门螺杆菌(Non-Helicobacter pylori helicobacters,NHPHs)主要感染各种动物,有时也可感染人类,因此,一部分NHPHs是人兽共患病病原菌。人类的非幽门螺杆菌感染率低,且其致病性弱或者不明确,如海尔曼螺杆菌(Helicobacter heilmanni)、肝螺杆菌(H.hepaticus,Hh)和胆螺杆菌(H.bilis,Hb)。肝螺杆菌和胆螺杆菌同时也是感染小鼠和大鼠的常见细菌,引起肝炎和肠炎,导致动物实验结果偏差。因此,在螺杆菌的研究中,幽门螺杆菌、海尔曼螺杆菌、肝螺杆菌和胆螺杆菌的检测最有价值。目前关于幽门螺杆菌和海尔曼螺杆菌感染检测的方法很多。另外,随着螺杆菌菌种不断增加,需要设计新的螺杆菌属的检测方法。因此,本研究建立检测螺杆菌属、肝螺杆菌和胆螺杆菌方法用来弥补目前检测螺杆菌方法的不足。由于粪便标本容易获得,而且可以从活体取得,套式PCR法特异性高,因此粪便标本的套式PCR检测是一种非常好的检测方法。本研究拟利用核糖体数据库(Ribosomal Database Project,RDP,提供细菌16S r RNA数据)建立敏感性和特异性好的套式PCR法并进行临床应用。第一部分螺杆菌特异性套式PCR检测方法的建立一、螺杆菌属特异性半套式PCR检测方法的建立目的:建立一种螺杆菌属特异性半套式PCR检测法。方法:根据34种螺杆菌标准菌株的16S r RNA设计了一组半套式引物。用粪便模拟标本、BLAB/c小鼠感染模型和临床标本检测该方法的通用性、敏感性和特异性。结果:粪便模拟标本中检测H.pylori(幽门螺杆菌),H.hepaticus(肝螺杆菌)和H.bilis(胆螺杆菌)的最低检出浓度为102 CFU/ml。在肝螺杆菌感染模型和胆螺杆菌感染模型分别成功检测到肝螺杆菌和胆螺杆菌。3例幽门螺杆菌阳性的患者中,该法都检测到了幽门螺杆菌,而C97/C05-C97/C98法只检测到2例患者感染幽门螺杆菌。结论:该法(G34法)检测螺杆菌通用性好、敏感性和特异性高。二、肝螺杆菌特异性套式PCR检测方法的建立目的:建立一种敏感性高、特异性强的检测肝螺杆菌的的套式PCR方法并对其临床应用进行探讨。方法:本研究基于9种肝螺杆菌亚种的16S r RNA基因设计筛选出1套套式引物(2条内引物、2条外引物),优化反应条件后,通过相关细菌、模拟粪便标本、动物模型标本和临床标本的检测对该套式PCR方法的敏感性、特异性进行评估。结果:该方法检测肝螺杆菌的最低检出浓度为102CFU/ml。幽门螺旋杆菌、胆螺杆菌、空肠弯曲菌、大肠埃希菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌检测结果均为阴性。本研究建立了3例感染肝螺杆菌的SPF级BLAB/c小鼠模型。该方法在3例模型的粪便和盲肠标本及2例模型的肝脏标本中检测出肝螺杆菌。10例胆石病患者中,该法检测出2例患者的胆汁、胆囊黏膜和粪便标本中有肝螺杆菌。临床标本的检测中,医疗干预、标本的类型和处理和PCR检测方法都会影响检测的结果。结论:本研究建立的套式PCR方法,敏感性高、特异性强,可以用于小鼠和人的肝螺杆菌感染。肝螺杆菌感染可能和人胆石病有关。医疗干预、标本的类型及处理和PCR检测方法都会影响临床标本的肝螺杆菌检测结果。三、胆螺杆菌特异性套式PCR检测方法的建立目的:建立一种敏感性高、特异性强的检测胆螺杆菌的套式PCR方法。方法:基于17种胆螺杆菌亚种的16S r RNA基因设计筛选出1套套式引物(2条内引物、2条外引物),优化反应条件后,通过模拟粪便标本、动物模型标本和临床标本的检测对方法的敏感性和特异性进行评估。结果:模拟粪便标本中,该方法检测胆螺杆菌的最低检出浓度为102CFU/ml.。3例感染胆螺杆菌的SPF级BLAB/c小鼠模型中,3例小鼠粪便和盲肠中均可检测到胆螺杆菌,1例肝脏标本中检测到了胆螺杆菌。10例胆石病患者中,有2例患者的胆汁、胆囊粘膜和粪便标本中检测到了胆螺杆菌。结论:本研究建立的套式PCR方法,敏感性高、特异性强,可用于检测胆螺杆菌的感染。第二部分G34法(螺杆菌属特异性半套式PCR法)的临床应用目的:检测G34法在临床应用中的效能。方法:本研究中纳入100例慢性上腹不适患儿,50例男性,50例女性,分别采用幽门螺杆菌血清学检测(Helicobacter pylori Serum antibody,Hp SA)法和螺杆菌属特异性半套式PCR方法(G34法)检测患儿的幽门螺杆菌感染情况。数据结果用IBM-SPSS22.0软件统计分析。结果:100例患儿中,Hp SA法检测到27例(27.0%)患儿感染H.pylori;G34法检测到26例(26.0%)患儿感染H.pylori,2例感染H.bilis,无螺杆菌重叠感染。进一步用H.bilis特异性套式PCR法检测2例感染H.bilis患儿的粪便标本也是阳性。结论:G34法不仅可以用于儿童幽门螺杆菌感染的检测,还可用于非幽门螺杆菌感染的检测。