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目的:1、观察重组腺病毒载体Ad5F11Bs感染人胎盘来源的间质充干细胞(Human plancenta-derived mesenchymal stem cells,HPMSCs)的效率;探讨Ad5F11Bs应用于HPMSCs介导的基因治疗的可行性。2、观察表达外源性kringle1-5蛋白转基因HPMSCs(K1-5HPMSCs)在体内报告基因EGFP基因的表达,推测HPMSCs的存活情况。3、观察K1-5HPMSCs在体内及体外对微血管生成的影响。4、探讨表达外源性Kringle1-5(K1-5)蛋白的HPMSCs治疗卵巢癌的可行性。5、应用能量多普勒超声造影观察评价K1-5HPMSCs对微血管形成的影响。6、K1-5HPMSCs对活体动物器官组织血管生成的影响。 方法:1、胶原酶消化法从新鲜的胎盘组织中提取成纤维样细胞,在含有10%的胎牛血清的DMEMF12的培养液中培养。2、通过观察其生长特性、脂肪细胞和成骨细胞分化实验及通过流式细胞仪进行HPMSCs的表面抗原的检测,对HPMSCs进行鉴定。3、选取感染复数MOI:50,用重组腺病毒载体:rAd-K1-5及rAd-EGFP分别感染HPMSCs至48h;应用荧光显微镜观察转染效率。4、MOI为50时,提取两种转基因HPMSCs的总RNA,RT-PCR方法检测感染rAd-K1-5的HPMSCs(K1-5-HPMSCs)中Kringle1-5基因mRNA表达情况;Western blotting方法检测Mock-HPMSCs和K1-5-HPMSCs条件培养液(Mock-CM和K1-5-CM)中的Kringlel-5蛋白水平。5、建立主动脉环血管生成体外模型,6d后观察基质胶内微血管形成的情况,并照相。6、建立裸鼠基质胶栓模型,1-14d时将裸鼠放于荧光成像系统内进行荧光成像,观察荧光的强度及其变化。7、基质胶模型于14d时进行能量多普勒超声造影,分析能量多普勒超声增强的面积,增强百分比。8、基质胶栓取出后进行HE染色,计算其内微血管密度。9、建立卵巢癌裸鼠皮下移植瘤动物模型,并在10、20d时在肿瘤细胞移植部位定期注射K1-5HPMSCs、Mock-HPMSCs、HPMSCs、DMEMF12进行干预治疗。10、卵巢癌裸鼠皮下移植瘤形成的30d时进行能量多普勒超声造影,分析能量多普勒超声增强的面积、增强百分比。11、采用免疫组织化学方法检测各组荷瘤鼠卵巢癌肿块内vWF表达。12、对荷瘤鼠的肝、脾、肾、肺、心脏组织进行HE染色,观察细胞形态的变化。经兔耳缘静脉注射K1-5HPMSCs,移植30天时灰阶超声造影观察兔肾脏的灌注情况。 结果:1、从人胎盘组织成功地提取成纤维样细胞具有贴壁生长特性;CD166,CD73表达阳性,不表达CD105,CD31,CD14;可向成骨细胞、脂肪细胞分化。证明从人胎盘组织提取的成纤维样细胞是间充质干细胞(MSCs)。2、MOI为50时MOCK-HPMSCs和K1-5HPMSCs组转染效率分别为95.2±8.5%和93.3±6.0%(p>0.05),二组间无显著性差异。3、HPMSCs及Mock-HPMSCs中不表达Kringlel-5基因,而K1-5-HPMSCs组中Kringle1-5基因的mRNA呈强阳性表达;显著高于对照Mock-HPMSCs组(p<0.001)。K1-5-CM组中Kringle1-5蛋白的表达阳性,而Mock-CM组中弱表达,二者差异有显著性(p<0.001)。4、与对照组相比,K1-5HPMSCs组基质胶栓中的微血管的形成明显减少(p<0.01)。5、基质胶栓荧光成像中,连续观察14d,混入转基因HPMSCS的基质胶栓内仍然可见绿色荧光。而未转基因HPMSCs组及Control组未见明显荧光。6、能量多普勒超声增强时,各组均可见显著性造影时,与其他三组相比,K1-5-HPMSCs组增强的面积及增强的百分比明显减少,差异有显著性意义(p均<0.001)。7、HE染色显示,与其他对照组相比,K1-5-HPMSCs组基质胶栓微血管密度明显减少,差异有显著性(p<0.01)。8、能量多普勒超声造影时,各组均可见显著性增强,K1-5-HPMSCs组裸鼠卵巢癌肿块血管增强的面积及增强的百分比明显小于其他三组,差异显著性意义(p<0.001)。9、裸鼠卵巢癌肿块免疫组化显示,与其他对照组相比,K1-5-HPMSCs组肿块内MVD明显减少(p<0.001)。10、K1-5HPMSCs处理组与其他各组相比,荷瘤鼠心、肝、肾、脾、肺组织细胞形态无明显变化,血管生成无显著性差异。K1-5-HPMSCs移植30天时经狄阶超声造影观察兔肾脏的灌注情况,肾实质的灌注参数无显著性差异。 结论:1、新鲜的人胎盘组织存在丰富的间充质干细胞。2、感染复数为50时,重组腺病毒载体Ad5F11Bs可高效感染人胎盘来源的间充质干细胞(HPMSCs)。3、感染rAd-K1-5病毒的HPMSCs能表达Kringle1-5基因并分泌Kringle1-5蛋白。4、表达外源性Kringle1-5蛋白的HPMSCs能够体外抑制主动脉环新生血管生成。5、转基因HPMSCs能在体外存活2周以上。6、能量多普勒超声造影在实时评估裸鼠卵巢癌移植瘤微血管生成治疗的效果上具有可行性,能量多普勒超声造影的增强面积与增强的百分比的大小反映了肿瘤内微血管的生成情况。7、表达外源性Kringle1-5蛋白的HPMSCs能够抑制裸鼠卵巢癌皮下移植瘤血管生成。8、K1-5HPMSCs对卵巢癌荷瘤鼠靶器官以外的组织细胞形态和血管生成没有明显影响。