肺癌是我国乃至全世界发病率及死亡率均较高的恶性肿瘤之一,而非小细胞肺癌NSCLC (non small cell lung cancer,NSCLC)占全部肺癌的80%以上。虽然人们目前对于非小细胞肺癌发病、早期诊断和治疗已经进行了非常深入的研究,但其确切发生、发展的分子机制尚不明确,有待于进一步研究以期在非小细胞肺癌早期诊断和治疗上取得进一步的突破。肝癌缺失基因(deleted in liver cancer 1,DLC-1)是在肝癌研究中被首次发现的一种抑癌基因,它位于人体第8号染色体的21.3-22区域。DLC-1基因在乳腺癌、鼻咽癌、胰腺癌、大肠癌、胃癌等多种恶性肿瘤中的表达及相关机制是当今研究的热点之一。当前研究表明,在大多数恶性肿瘤中DLC-1呈现出低水平表达甚至是表达缺失,恢复DLC-1的表达能够显著地抑制肿瘤细胞的增殖能力,促进肿瘤细胞的凋亡。可见,研究DLC-1在恶性肿瘤中的表达机制,对于发现新的肿瘤治疗靶点和新的肿瘤治疗方法具有十分重要的意义。目前国内外对于DLC-1在肺癌中的研究相对较少,DLC-1与患者的生存率方面的研究尚属空白,DLC-1在肺癌中发挥作用的机制并不明确。本课题通过研究DLC-1在非小细胞肺癌组织和癌旁组织中的表达差异,分析DLC-1与患者性别、吸烟史及肿瘤病理类型、分化程度、淋巴结是否转移、TNM分期的相关性,探讨DLC-1与肺癌发生发展的关系；并构建了pcDNA3.1-DLC-1质粒,在非小细胞肺癌细胞株中过表达该质粒,探索DLC-1对非小细胞肺癌细胞生长、侵袭的影响；有报道表明,DLC-1可能通过RhoA/ROCK信号通路调控肿瘤的发生及生长,因此本研究也探索了DLC-1对于ROCK1的影响,探索DLC-1与RhoA/ROCK信号通路的关系。对于DLC-1在肺癌中发挥作用的机制进行研究,为发现新的肿瘤治疗靶点和新的肿瘤治疗方法提供新的思路。本研究分为以下三个部分：第一部分非小细胞肺癌中DLC-1、ROCK1蛋白表达水平的检测及临床意义目的探索非小细胞肺癌组织中肝癌缺失基因DLC-1基因和Rho相关卷曲螺旋形成蛋白(Rho-kinase 1,ROCK1)的蛋白表达水平,分析两种蛋白与各项临床指标的相关性。方法1.本研究回顾性分析了2011年1月至2012年6月在滨州医学院附属医院胸外科进行外科手术治疗的68例非小细胞肺癌病人的临床资料,所有病人均经病理检查证实,且术前未行放化疗等抗肿瘤治疗。收集68对非小细胞肺癌的癌组织及对应的癌旁组织石蜡包埋块。2.采用Envision免疫组织化学技术检测DLC-1基因与ROCK1基因在癌组织及对应的癌旁组织中的表达水平。3.分析DLC-1、ROCK1与各项临床指标的相关性,并研究两种蛋白表达水平的相关性。4.所有患者的随访截止到2015年3月。5.生存期计算从手术日期至死亡或2015年3月末次随访结束。根据随访结果比较DLC-1不同表达组之间生存期的差异。结果1.免疫组化结果显示：DLC-1蛋白在非小细胞肺癌组织中呈现低水平表达甚至是表达缺失,其阳性表达率为38.24%(26/68),明显低于癌旁组织75%(51/68),二者的表达差异有统计学意义(X2=14.256, P<0.01): ROCKI蛋白在非小细胞肺癌中的阳性表达率为57.35%(39/68),在癌旁组织呈表达缺失,二者的表达差异有统计学意义(X2=45.378,P<0.01)；2.在非小细胞肺癌组织中,DLC-1、ROCKI蛋白的表达与性别、吸烟史有无及肿瘤的病理学类型无关,而与肿瘤分化程度、淋巴结转移及TNM分期有关,差异有统计学意义；非小细胞肺癌DLC-1阳性表达组中ROCK1的阳性表达率为34.62%(9/26),DLC-1阴性表达组中ROCK1的阳性表达率为71.43%(30/42),相关分析提示,DLC-1与ROCK1的表达中呈负相关(r=-2.359,P=0.04)；3.DLC-1蛋白高表达组的3年生存率(88%)高于低表达组(57.2%),差异有统计学意义(P=0.031)。结论DLC-1蛋白在非小细胞肺癌组织中呈现低表达水平甚至是表达缺失,与ROCK1蛋白呈现明显的负相关性,这表明DLC-1在非小细胞肺癌中发挥作用的机制可能是通过调控ROCK1信号通路。DLC-1蛋白可以作为检测非小细胞肺癌患者预后水平的潜在指标之一。第二部分DLC-1、ROCK1在非小细胞肺癌组织及细胞株中的表达及其相关性研究目的研究非小细胞肺癌新鲜组织及细胞株中DLC-1和ROCK1的蛋白及mRNA水平的表达情况及二者的相关性。方法1.收集新鲜非小细胞肺癌组织及癌旁组织各23例,肺癌细胞株H1299、A549及Calu6。2.运用逆转录聚合酶链反应(Real time RT-PCR)检测新鲜肺癌组织中DLC-1及ROCK1基因mRNA水平的表达情况。3.运用逆转录聚合酶链反应(Real time RT-PCR)及Western Blot检测肺癌细胞株中的DLC-1及ROCK1基因mRNA水平及蛋白水平的表达情况。结果1.共收集肺癌及癌旁组织各23例,结果提示在肺癌组织中DLC-1 mRNA的表达量明显低于癌旁组织,ROCK1则在肺癌组织中表达量高于癌旁组织,二者亦存在负相关的关系。2.在肺癌H1299细胞株中,DLC-1基因mRNA水平及蛋白水平表达呈阳性,而在A549、Calu6细胞株中则呈阴性；ROCK1的结果与之相反。结论DLC-1在肺癌新鲜组织及细胞株中呈低表达或表达缺失,ROCK1则相反,进一步证实DLC-1在非小细胞肺癌中发挥作用的机制可能是通过对于ROCK1信号通路的调控。第三部分pcDNA3.1-DLC-1重组载体的构建及DLC-1对肺癌细胞的生物学功能的影响目的构建DLC-1基因的表达载体pcDNA3.1-DLC-1,在肺癌细胞系中过表达DLC-1蛋白,探索DLC-1蛋白对于肺癌细胞株生长、侵袭及凋亡的影响,对ROCK1表达的影响,进一步探讨DLC-1蛋白在非小细胞肺癌中发挥作用的机制,为非小细胞肺癌的诊断及治疗提供新的临床思路及理论依据。方法1.DLC-1表达载体的构建：提取肺癌细胞株H1299总RNA,通过逆转录酶合成cDNA;应用RT-PCR扩增DLC-1基因全序列ORF,插入真核表达载体pcDNA3.1.2.DCL-1对ROCK1表达的影响：用无内毒素抽提方法抽取已构建好的表达载体,脂质体瞬时转染A549、Calu6细胞,48小时后抽取细胞RNA,逆转录cDNA,鉴定RNA和cDNA质量,设计ROCK1引物,RT-PCR鉴定ROCK1基因表达变化。以质粒空载pcDNA3.1转染的A549、Calu6为阴性对照。3.DLC-1对非小细胞肺癌侵袭能力的影响：用无内毒素抽提方法抽取已构建好表达载体,脂质体瞬时转染A549细胞,利用transwell小室实验评估其对肿瘤细胞侵袭能力的影响。4.DCL-1对非小细胞肺癌生长能力的影响：用无内毒素抽提方法抽取已构建好表达载体,脂质体瞬时转染A549、Calu6细胞,稀释至200cells/10ml,接种入6孔板,待克隆生长完成,以结晶紫染色,观察细胞生长情况。以质粒空载pcDNA3.1转染的A549、Calu6为阴性对照。5.DCL-1对非小细胞肺癌细胞周期及凋亡的影响：用无内毒素抽提方法抽取已构建好表达载体,脂质体瞬时转染A549细胞,DAPI染色,FACS检测其对细胞周期和凋亡的影响。以质粒空载pcDNA3.1转染的A549为阴性对照。结果1.应用基因克隆技术成功构建DLC-1基因真核表达载体pcDNA3.1-DLC-1.2.肺癌细胞株A549、Calu6中过表达DLC-1对ROCK1转录水平有着负性调控的作用。转染了pcDNA3.1-DLC-1后DLC-1在mRNA水平上有较高的过表达效果,结果具有显著性差异,P<0.05。对其中的ROCK1的mRNA水平进行检测可知,过表达DLC-1后,ROCK1的mRNA水平受到了显著的抑制,A549、Calu6中过表达DLC-1后的ROCK1的mRNA水平下降分别为对照组的33%、47%,结果均具有显著性差异,P<0.05。3.肺癌细胞株A549、Calu6细胞中过表达的DLC-1后,在体外侵袭实验中对实验组和对照组的穿膜细胞进行统计分别为26.8±1.3、67.8±5.2,结果具有显著性差异,P<0.05。克隆形成实验提示A549、Calu6细胞的克隆形成能力显著下降；A549细胞株的对照组的克隆形成率为38.9±2.6%,实验组的克隆形成率为21.8±5.2%,结果具有显著性差异,P<0.05; Calu6细胞株的对照组的克隆形成率为35.8±1.2%,实验组的克隆形成率为19.6±6.9%,结果具有显著性差异,P<0.05。流式结果显示过表达DLC-1后,可以显著抑制细胞周期,降低S期细胞和G2期细胞数,提高G1期细胞数,并可促进癌细胞的凋亡。结论在肺癌细胞中DLC-1的表达与ROCK1呈明显的负相关,且DLC-1能够显著地抑制肺癌细胞的增殖和侵袭能力,对肺癌细胞的细胞周期也具有明显的抑制作用,并促进了肺癌细胞的凋亡,因此,DLC-1可能是通过作用ROCK1调控肺癌的发生和发展。