湖羊羔皮不同花纹差异表达基因的筛选及其主效基因的功能验证

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本研究以湖羊为研究对象,利用基因芯片技术筛选湖羊大花、小花皮肤组织差异表达基因,并对湖羊大花、小花皮肤组织进行组织学分析;采集15只湖羊个体(大花、中花、小花),利用组织学与显微观测的方法,研究刚出生湖羊皮肤毛囊组织学特性,结合荧光定量PCR技术,检测差异表达基因在不同个体表达量与毛囊发育间的关联,筛选出用于后期功能验证的重要基因BMP7;利用基因克隆技术克隆湖羊BMP7基因的全序列,并利用生物信息学软件对湖羊BMP7基因与其他物种的同源性、蛋白质的理化性质、二级结构等进行生物信息学分析;构建pEGFP-C1-BMP7真核表达载体,旨在探索BMP7基因对湖羊毛囊细胞的调控机制,为深入了解湖羊羔皮不同花纹形成奠定理论基础。本研究获得以下结果:1、利用基因芯片技术共筛选出137个差异表达基因,部分基因参与细胞的增殖、分化、凋亡、发育、代谢、免疫应答等生物学过程,其中BMP7、MMP2、SNAI1、SFXN1、CDKNIC、MT3和POUlF1基因的差异表达表明其可能参与皮肤毛囊的形成。组织学研究表明湖羊皮肤毛囊组织初级毛囊/次级毛囊比值,小花组高于大花组,二者差异显著(P<0.05),毛囊总数虽二者差异不显著,但小花组多于大花组。初级毛囊直径小花组小于大花组,二者差异显著(P<0.05)。次级毛囊直径小花组小于大花组,二者差异极显著(P<0.01)。2、在7个候选基因中,MMMP2、BMP7、SFXN1基因在大、中、小花间表达差异显著(P<0.05),其余基因表达差异不显著(P>0.05);MMP2基因相对表达量与大花次级毛囊数呈显著正相关(P<0.05);BMP7基因相对表达量与小花初级毛囊直径呈显著正相关(P<0.05),与小花次级毛囊数呈极显著正相关(P<0.01),与中花初级毛囊直径、次级毛囊数呈显著负相关(P<0.05);SFXN1基因相对表达量与大花初级毛囊呈显著负相关(P<0.05),与小花初级毛囊直径、小花次级毛囊直径分别呈显著正相关及极显著正相关,与中花初级毛囊直径呈极显著负相关。其余基因虽与毛囊相关指标存在关联,但鉴于其在大中小花组表达差异不显著。初步推测BMP7、MMP2、SFXN1三个基因可作为湖羊早期羔皮选育的重要候选基因。3、BMP7基因完整CDS全长为1296bp,共编码431个氨基酸,分子量为49316.9Da,理论等电点pI为7.75,属于不稳定蛋白。核苷酸序列同源性分析结果表明BMP7基因氨基酸序列与牛、人、家犬同源性较高,与斑马鱼、泥蚶同源性相对较低。在330-431氨基酸处存在一个TGFβ超家族结构域,具有TGFβ家族属性。亚细胞定位结果显示BMP7基因大部分定位于细胞内,在细胞内合成后,分泌到细胞外起作用,属于分泌蛋白。功能预测分析结果表明,BMP7蛋白在翻译、脂肪酸的代谢等过程中发挥重要作用,同时对细胞过程、中央中介代谢等也起到关键作用。4、重组质粒pEGFP-C1-BMP7经PCR、酶切、测序鉴定,证实BMP7基因CDS区已经正确克隆至pEGFP-C1表达载体,本研究为探索BMP7基因在湖羊毛囊细胞增殖、分化过程中奠定了实验基础。
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