膀胱癌(bladder cancer,BC)是发病率第六位的世界性恶性肿瘤,也是我国最常见的泌尿系统恶性肿瘤,其中尿路上皮癌(urothelial cell carcinoma,UCC)占膀胱癌的90%左右,约50%-70%的患者会出现术后复发。除此之外,约40%的患者其肿瘤的恶性程度会增加,而最终将有20-30%的患者将死于膀胱癌。目前BUCC的诊断和监测主要依靠膀胱镜、尿脱落细胞学(urine cytology)等检查手段,膀胱镜检查属于有创性检查,其检测效果尚可,但会给患者造成生理创伤和精神痛苦,造成患者的恐惧与回避；而尿脱落细胞学检测耗时长,阳性率不高,不适合作为一个早期检测膀胱癌的筛查手段；在治疗方面,无论是手术治疗还是辅助化疗,均很难达到彻底根治效果,寻找治疗BUCC的新方法是时下急需解决的难题。因此,研究BUCC发生发展的分子生物学机制,从分子水平上探明膀胱癌的发生、增殖、侵袭及迁移机制,发现BUCC的早期诊断、预后估计的无创性敏感指标,拟定分子靶向治疗的理论基础和可能方案,从而提高膀胱癌的临床诊疗水平,是泌尿外科临床和科研上急需解决的热点和重要课题。整合素连接激酶(ILK)作为一个重要的信号整合器在人类癌症发展过程的上皮间质化(EMT)过程中起着重要的作用,但其机制尚不完全清楚。研究发现,ILK在细胞内有蛋白激酶B(protein kinase B, PKB/AKT,PKB可以通过直接磷酸化下游蛋白底物发挥抗凋亡作用)和糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)两个催化位点,ILK能通过磷酸化PKB和GSK-3β参与到相应的信号通路。磷酸化的PKB生物活性降低,使得细胞凋亡受抑制,使肿瘤细胞存活时间延长；GSK-3β的磷酸化导致细胞周期蛋白D1(cyclinD1)等基因的表达上调并影响细胞周期,促进细胞增殖；ILK的过量表达还能够通过磷酸化PKB而诱导转录因子Snail和ZEB1的表达,从而抑制E-钙粘蛋白(E-cadherin)的表达,其在肿瘤细胞内的表达受抑可提高肿瘤的侵袭和转移率,促进肿瘤的侵袭和迁移；与此伺时,ILK也能刺激MMP-9的表达,并通过磷酸化PKB诱导MMP-2的表达,促进细胞的侵袭和迁移。ILK可调配细胞外基质及生长因子的信号传导,调控细胞的生长、分化、迁移。国外学者研究发现膀胱癌细胞中ILK表达显著升高,并能通过对E-cadherin和MMP-9表达的调节提高膀胱癌的侵袭性,而MMP-2在此过程中无明显变化。国内学者王德林等和朱军等分别研究ILK与膀胱癌的关系,其结果显示ILK的表达分布与BUCC病理分级有关,而与临床分期无关,且其通过影响E-cadherin、MMP-2和MMP-9促使肿瘤细胞侵袭迁移。结果与国外学者研究不完全一致。总而言之,目前关于ILK对膀胱癌发生发展影响的研究并不充分,其中部分机制仍未研究透彻,而对于MMP-2在膀胱癌细胞迁移过程中的作用结论不统一。本研究分为三个部分,在临床标本与体外细胞培养两个水平研究BUCC中ILK基因的表达及其意义,揭示ILK与BUCC发生发展的相关性：第一部分采用Western-blot, RT-PCR的方法分别检测膀胱尿路上皮癌组织和癌旁正常膀胱组织中ILK和ILK mRNA的含量,探究ILK基因的表达与BUCC的关系,以及ILK与BUCCI临床病理特点之间的关系。第二部分选择人尿路上皮癌T24细胞进行体外实验,通过构建一套瞬时转染ILK-siRNA模型,转染尿路上皮癌T24细胞并通过RT-PCR筛选出最有效的干扰序列,将T24细胞分为3组,即膀胱尿路上皮癌T24细胞+ILK-siRNA组(目的转染组),膀胱尿路上皮癌T24细胞组(阴性对照组)和膀胱尿路上皮癌T24细胞阴性siRNA转染组(阴性转染组),分别采用RT-PCR和Western-blot及免疫荧光的方法定量检测3组细胞中ILK mRNA和ILK的表达,分析通过siRNA沉默ILK表达的模型建立是否成功。第三部分采用流式细胞术、MMT法分别检测3组细胞的细胞增殖能力和凋亡率,进行细胞侵袭、迁移、粘附实验,检测3组细胞的侵袭、迁移、粘附能力,最后采用Western-blot的方法分别检测3组细胞中E-cadherin、MMP-2表达的水平。目的：分析人膀胱尿路上皮癌组织中ILK基因的表达及其意义。方法：采用Western-blot方法定量检测膀胱尿路上皮癌组织和正常癌旁膀胱组织中ILK的表达,采用RT-PCR方法定量检测膀胱尿路上皮癌组织和癌旁正常膀胱组织中ILK mRNA的表达,并使用SPSS19.0软件进行统计学分析。结果：(1)ILK、ILK mRNA在BUCC组织中表达水平偏高,而在癌旁正常组织中其表达水平明显较低,且两者差异具有统计学意义(P<0.05),提示ILK基因的表达上调与BUCC的发生具有显著相关性。(2)ILK的表达与患者性别、年龄、肿瘤数目、肌层浸润、肿瘤复发与否、淋巴结转移、临床分期等因素均无显著相关性,但与肿瘤分化程度相关(P<0.05)。结论：(1)ILK基因的表达上升与BUCC的发生密切相关。(2)ILK基因的表达与BUCC的病理分级呈正相关,与其他临床特征无明显相关性。(3)ILK基因可作为早期诊断BUCC的分子标志物,并可用于对于患者预后的评估。目的：研究人膀胱尿路上皮癌T24细胞中ILK基因的表达,分析通过siRNA沉默ILK基因表达模型的建立是否成功。方法：选择人尿路上皮癌T24细胞进行体外实验,通过构建一套ILK-siRNA转染模型,转染T24细胞并通过RP-PCR检测出最有效的干扰序列,将T24细胞分为3组,即膀胱尿路上皮癌T24细胞+ILK-siRNA组(目的转染组),膀胱尿路上皮癌T24细胞组(阴性对照组)和膀胱尿路上皮癌T24细胞阴性转染组(阴性转染组)分别采用RT-PCR和Western-blot及免疫荧光的方法定量检测3组细胞中ILK mRNA和ILK的表达。结果：免疫荧光、Western-blot及RT-PCR检测均显示目的转染组细胞中ILK及ILK mRNA的表达较阴性对照组和阴性转染组显著降低。阴性对照组和阴性转染组细胞中ILK、ILK mRNA的表达无明显差异。结论：构建瞬时转染ILK-siRNA模型下调膀胱尿路上皮癌T24细胞中ILK基因的表达效果显著。目的：通过ILK-siRNA转染模型验证人膀胱尿路上皮癌细胞中ILK基因沉默与膀胱尿路上皮癌细胞生物特性之间的关系。方法：采用流式细胞术、MMT法分别检测目的转染组、阴性对照组和阴性转染组3组细胞的细胞增殖能力和凋亡率,进行细胞侵袭、迁移、粘附实验,检测3组细胞侵袭、迁移、粘附能力的不同,最后采用Western-blot的方法分别检测3组细胞中E-cadherin、MMP-2表达的不同。结果：流式细胞术检测结果发现目的转染组的细胞凋亡率较其他两组显著增高。流式细胞术和MTT实验结果表明目的转染组细胞的增殖能力较其他两组明显下降。肿瘤细胞侵袭、迁移、粘附实验检测结果发现目的转染组的细胞侵袭、迁移和粘附能力较其他两组明显下降,结果具有统计学意义(P<0.05)。由Western-blot法分别定量检测3组细胞MMP-2和E-cadherin的表达水平,结果显示降低ILK的表达能够提高E-cadherin的表达,降低MMP-2的表达。结论：(1)沉默ILK基因可以促进膀胱尿路上皮癌细胞凋亡。(2)沉默ILK基因可以抑制膀胱尿路上皮癌细胞的增殖、侵袭、迁移和粘附能力。(3)沉默ILK基因可提高膀胱尿路上皮癌细胞中E-cadherin的表达,降低MMP-2的表达。