论文部分内容阅读
鼻病毒(rhinovirus,RV)属于小核糖核酸病毒(Picornavirus)肠道病毒属(Enterovirus),单股正链RNA病毒,根据血清型和抗原分型分为100种型,主要分为A组鼻病毒和B组鼻病毒。近些年来,在流感样呼吸道疾病的患者中发现了新的分型,它们的基因序列提示它们可能是新的鼻病毒,即C组鼻病毒。研究显示三组鼻病毒的病毒学特征不同,其中RV-B的复制效率低,在与RV-A或RV-C比较时,RV-B感染产生的细胞因子少,细胞毒性低。临床资料显示RV-C与哮喘发作关系密切,60%的哮喘住院病人标本检测出RV-C感染,并且在引起重症哮喘发作的风险性C组鼻病毒比其他病毒更高。临床流行病学的研究中发现在重症哮喘的患者中,A组和C组鼻病毒的检出率明显高于B组鼻病毒。对于基因组长约7200个核苷酸的鼻病毒来说,却只有1个开放阅读框,编码一个多聚蛋白,该多聚蛋白前体被病毒编码的蛋白水解酶2A和3C酶切成4个结构蛋白和7个非结构蛋白。鼻病毒的3C蛋白是半胱氨酸蛋白酶,在病毒复制以及对抗宿主免疫反应中起到重要作用。前期已有研究证实C组鼻病毒的致病能力比A组和B组鼻病毒要强,由于C组鼻病毒不能单独在体外用细胞进行培养,因此为研究C组鼻病毒导致呼吸道疾病的分子机制造成一定的困难。为了揭示鼻病毒与哮喘严重程度的关系,本课题拟构建A组鼻病毒的感染性克隆和用属于C组鼻病毒的LZ651病毒3C蛋白基因替换属于RV-A的RV1B感染性克隆的3C基因,从而拯救嵌合病毒RV1B-651。感染卵清蛋白致敏的哮喘小鼠,检测小鼠的呼吸道过敏反应指标,比较RV1B和RV1B-651感染诱发的哮喘严重程度。目的:1.构建A组鼻病毒RV1B的感染性克隆以及嵌合鼻病毒RV1B-651的感染性克隆,以便为下一步研究3C蛋白与急性哮喘的关系打下基础。2.研究A组鼻病毒RV1B同嵌合病毒RV1B-651对哮喘模型小鼠的影响,从而揭示鼻病毒3C蛋白与哮喘严重程度的关系,从而为进一步研究3C蛋白对哮喘的影响打下基础。方法:1.通过PubMed文库中基因组序列对构建A组鼻病毒RV-1B全长基因组进行感染性克隆,然后用属于RV-C的LZ651病毒3C蛋白基因替换属于A组鼻病毒的RV1B感染性克隆的3C基因,拯救构建嵌合病毒RV1B-651感染性克隆。转染Hela细胞后,拯救野生病毒RV1B和嵌合病毒RV1B-651;2.用A组鼻病毒野生型RV1B病毒和嵌合病毒RV1B-651病毒感染卵清蛋白致敏的哮喘小鼠,检测小鼠的呼吸道过敏反应指标,比较RV1B和RV1B-651引起哮喘严重程度。结果:1.成功构建了A组鼻病毒RV1B的感染性克隆和嵌合病毒RV1B-651感染性克隆。获得的RV1B和RV1B-651的感染性克隆病毒感染Hela细胞,并用实时荧光定量PCR检测到随着感染时间延长病毒在核酸水平上的提高,同时用免疫荧光的技术检测到病毒VP1蛋白的表达。2.在BALF液中细胞因子的检查中,OVA组的干扰素IFN-γ、IFN-α因子较PBS组增加(P<0.05);RV1B/OVA组和RV1B-651/OVA组比OVA组IFN-γ、IL-4、IFN-α均明显增加(P<0.05);RV1B-651/OVA组较RV1B/OVA组IFN-γ、IL-4均明显增加(P<0.05)。在肺病理组织检查中,可见RV1B/OVA组,RV1B-651/OVA组以及OVA组相对于PBS组均具有较明显的炎性细胞浸润。结论:本研究成功构建了A组鼻病毒的感染性克隆RV1B和嵌合病毒RV1B-651的感染性克隆,发现了病毒核酸水平上的提高与病毒蛋白的成功包装,拯救了RV1B病毒和RV1B-651嵌合病毒,为研究3C蛋白与哮喘关系的影响打下了基础。哮喘小鼠模型是由卵清蛋白致敏可成功诱导的;3C蛋白基因可能是导致RV1B病毒和RV1B-651嵌合病毒感染卵清蛋白致敏哮喘小鼠后细胞因子水平差异的原因,其具体机制还有待深入研究。