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脂肪酸去饱和酶(fatty acid desaturase,FAD)是合成不饱和脂肪酸(unsaturated fatty acid,UFA)的关键酶,它可以在饱和脂肪酸(saturated fatty acid,SFA)中引入单个或多个不饱和键,形成单不饱和脂肪酸(monounsaturated fatty acid,MFA)或多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA)。在动物中,PUFA是机体必须脂肪酸,哺乳动物特别是人需要通过摄取外源PUFA来维持机体正常运行。在植物中,PUFA能够维持细胞膜的相对流动性,以保证细胞的正常生理功能,另外PUFA在植物应对生物与非生物胁迫方面具有重要作用。UFA及其衍生物还可以用于工业生产。PUFA可以分为ω-3 PUFA和ω-6 PUFA两类,其中ω-3 PUFA同维生素、矿物质一样是动物体必不可少的营养物质,摄入量不足容易引起心脏和大脑等生命器官代谢障碍。花生是世界上重要的油料作物和经济作物之一,籽粒含油量在50%左右,油酸和亚油酸约占总脂肪含量的80%,UFA含量丰富,但是ω-3 PUFA含量较低。随着世界对花生需求的逐年递增,提高花生产量及改善花生油品质越来越受到人们的关注。以往关于花生的研究主要集中在高产、高油酸育种方面,而对提高ω-3 PUFA的研究较少。本实验从花生栽培种丰花1号(FH-1)中克隆了多个ω-3花生FAD(co-3 AhFAD)基因及其启动子,并对其进行了功能验证。主要结果如下:1:AhFA 基因家族的生物信息学分析。在花生基因组中共有31个AhFAD基因,分为8类,AhSAD基因亚家族有12条序列,AhFAD2有6条序列,AhFAD3有4条序列,AhFAD4/5有3条序列,AhFAD6有2条序列,AhFAD7/8有4条序列。A基因组中有15个AhFAD,分布于8条染色体上;B基因组中有16个AhFAD,分布于7条染色体上。聚类分析显示AhFAD有两大分支:游离AhSAD分支和膜结合AhFAD分支。膜结合AhFAD分支中AhFAD4/5起源最早,ω-3 AhFAD由ω-6 AhFAD进化而来;单、双子叶FAD聚类于不同分支。亚细胞定位分析发现AhFAD2和AhFAD3定位于内质网上,其它AhFAD均定位于叶绿体。可变剪接分析表明,有12个AhFAD发生了可变剪接,TTS和TSS是发生最多的可变剪接事件,其次是IR,最少的是AE和ES。2:ω-3 AhFAD基因克隆与序列分析。根据野生花生基因组(https://www.peanutbase.org/)序列信息设计特异性引物,克隆得到7个ω-3 AhFAD基因序列,其中4个A F D 基因(AhFAD8-1、AhFAD8-3、h4 AhFAD8-4)和 3 个 AhFAD3 基因(AhFAD3-1、AhFAD3-2、AhFAD3-3)。3 对同源基因分别为AhFAD8-和AhFAD8-2、AhFAD8-1 和 AhFAD8-4、AhFAD3-2 和AhFAD3-3。AhFAD8-1有2个可变剪接异构体,AhFAD8-1.1和AhFAD8-1.2。基因CDS碱基数目在1100-1400 bp不等,编码400个氨基酸左右,基因结构均含有8个外显子7个内含子。与其他植物ω-3 FAD序列对比和保守结构域分析发现,除AhFAD8-1.1外,其余7个序列均具有ω-3 FAD的保守结构域和3个组氨酸富集区。AhFAD8-1.1具有保守结构域,但是可变剪接造成第三个组氨酸富集区部分缺失。3:co-3 AhFAD的表达模式分析。利用Taqman-PCR方法检测花生8个组织中各基因的表达水平。结果显示,该方法检测到6个基因的表达,其表达模式具有各自不同的特点。在根、茎、叶和花四个组织中,AhFAD8-1和AhFAD8-2在叶和花中的表达量高于根和茎,其中叶中最高,根中最低;AhFAD8-3和AhFAD8-4在根中的表达量最高,其次是花,在茎和叶中的表达量较低;AhFAD3-1在四个组织的表达量都较低;AhFAD3-3在花中表达量最高,叶中次之,茎和根中表达量低。在花生种子发育的四个时期(果针入土 15d、30d、45d和60d),这6个ω-3 AhAD均在种子发育前期(15 d和30 d)表达量高,种子发育后期(45 d和60 d)表达量低。AhFAD8-1、AhFAD8-2和AhFAD8-3在15 d的表达量明显高于30 d;而AhFAD3-1和AhFAD3-3在30 d的表达量高于15 d;AhFAD8-4在15 d和30 d的表达量都比较高,二者无明显差异。4:ω-3AhFAD的亚细胞定位分析。用拟南芥原生质体瞬时表达方法检测各基因的亚细胞定位情况,结果显示4个AhFAD8定位在叶绿体膜上,3个AhFAD3定位在内质网膜上。5:获得ω-3 AhFAD转基因酵母。成功构建真核酵母表载体pESC-URA融合质粒,将其转化酿酒酵母W303感受态细胞,并获得转基因酵母阳性菌株。6:利用拟南芥遗传转化验证co-3 AhFAD功能。提取T2代纯合转基因拟南芥种子的脂肪酸进行甲酯化反应,用GC方法进行分析。结果显示,转基因拟南芥种子中几种主要脂肪酸含量增加,总脂肪酸含量升高8%-28%,亚麻酸含量平均升高2.4%,证明ω-3 FAD促进ALA的合成。利用T2代转基因拟南芥株系进行抗逆性实验,结果显示,不同盐浓度下转基因拟南芥幼苗成活率比野生型提高1%-13%,且AhFAD8-3和AhFAD8-4转基因拟南芥成活率最高。7:ω-3 hFAD启动子的功能验证。克隆7个基因相对应的启动子序列,其长度在1000-1500 bp不等。构建GUS-植物表达载体并转化拟南芥,对转基因株系进行GUS染色。结果表明,在根、茎、叶、花、果实和种子等部位均有较强的GUS染色反应,表明这7个启动子均具有启动活性。