丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)属黄病毒科(Flaviviridae)、丙型肝炎病毒属。HCV自1989年被发现以来,全球感染人口已经超过2亿人,其中每年新增病例3.5万。丙型肝炎病毒主要感染途径是血液传播、母婴传播和性传播等。一经感染,85%的感染者会转为慢性感染,其中约20%会引起肝纤维化、硬化,5%会发展成为肝癌。长效干扰素PEG-IFNα/利巴韦林联合已在临床广泛使用,DAA蛋白酶抑制剂--博赛匹韦或特拉匹韦、干扰素联合利巴韦林的三联治疗,已取得较好的治疗效果。最近,核苷类RdRp酶抑制剂sofosbuvir和NS5A抑制剂velpatasvir被美国FDA批准使用,并在此基础上发展了 Sovaldi(Sofosbuvir)和velpatasvir联合使用的Epclusa,此类药物对无肝硬化或代偿肝硬化(轻度肝硬化)患者均有较好疗效。但以上药物价格昂贵,有些已出现耐药突变,而针对丙型肝炎的疫苗也尚未研发成功,丙型肝炎疫苗和药物研发仍是尚未解决的人类医学难题。合适的动物模型是药物与疫苗研发的必要技术平台,对研究病毒感染进程和致病机制具有不可替代的作用。目前已创建和使用的HCV的动物模型有:人源化小鼠、转基因小鼠、大鼠、树鼩、黑猩猩等,但这些实验动物受到创制成本、亲缘关系、实验周期、饲养条件、伦理因素等限制,其广泛使用均受到一定限制。但随着基因工程技术的不断创新和发展,通过转基因方法建立基因工程灵长类动物疾病模型已成为可能。抗增生性抗体识别靶抗原(CD81)和紧密O连接蛋白(Occludin)都属于四次跨膜结构蛋白,被认为是HCV入胞的候选受体。研究证实CD81能和HCV包膜糖蛋白E2结合介导病毒感染细胞,CD81的表达量与HCV对细胞的感染性呈正相关关系。Occludin则被认为是影响HCV感染性高低的重要因素,在人肝细胞中超表达该分子可以显著增加HCV假病毒颗粒的感染。为建立稳定表达人源HCV受体的细胞,我们分别扩增获得人源CD81和Occludin基因,将其克隆至pLVX-IRES-ZsGreenl慢病毒表达载体上,通过磷酸钙转染至293T细胞,收取转染后上清,超速浓缩后得到滴度为107TU/mL的慢病毒颗粒。用该病毒颗粒分别感染人肝癌细胞HepG2、中国仓鼠卵巢细胞CHO和猕猴骨髓间充质干细胞BMSCs,可在感染的HepG2和CHO细胞中检测到CD81和Occludin mRNA的表达,间接免疫荧光和流式细胞检测结果确认CD81和Occludin分子在HepG2和CHO细胞表面表达,同时Western-blot也检测到CD81和Occludin蛋白,以上结果均表明CD81和Occludin两个受体的稳定表达。进而,我们从猕猴股骨处分离得到骨髓间充质干细胞,经细胞表面特异分子的流式检测以及细胞分化功能测定发现:CD34和CD45表面分子表达呈阴性,而CD44、CD90、CD105呈阳性;分别用成脂、成骨培养基诱导细胞分化到7天和21天,通过油红、茜素红和阿尔新蓝染色验证了分离培养的间充质干细胞具有分化为成骨、成脂、成软骨的潜能,可确定为细胞为骨髓间充质干细胞。将间充质干细胞传代培养至第三代后,用慢病毒颗粒感染至间充质干细胞中,可检测到CD81和Occludin的稳定表达。最后,我们分别用HCVpp和HCVcc感染稳定表达人CD81和Occludin的细胞,Real-Time PCR法HCV病毒载量检测发现,CD81在HepG2细胞中能提高HCV入胞能力,该作用在HCVpp的免疫荧光检测得到验证;而在CHO细胞中,Occludin分子对于HCV入胞的介导作用不明显;在猕猴骨髓间充质干细胞中,免疫荧光法可明显检测到HCVpp中GFP蛋白,说明CD81和Occludin分子均能介导HCVpp的进入猕猴间充质干细胞。综上所述,本研究初步构建了 HCV感染猕猴骨髓间充质干细胞的体外细胞模型,该模型为最终建立丙型肝炎灵长类动物模型奠定了前期研究基础,对于研究HCV感染与致病机制也具有重要意义。