论文部分内容阅读
通过厌氧培养和好氧培养的方法,对中国大陆科学钻探(CCSD)工程中不同深度岩心样品的微生物进行了研究,探索建立了一系列针对大陆深部地层微生物的培养分析方法。
采用厌氧培养分析结果表明,所有地下430米到5112.05米的13个不同深度岩心样品中没有产甲烷菌生长,其中一个现场取样的岩心样品S-WL2的硫酸盐还原菌培养基培养物存在可疑的生命活动现象。培养物扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)的观测结果中,培养物大小非常接近,长2—3μm,直径0.5-0.7μm;对培养物的蛋白含量测定表明,培养物在120℃培养2天时蛋白含量达到最大值10μm;对培养物中的丙酮酸、乳酸和乙酸进行了液相色谱(HPLC)分析,结果表明培养物中丙酮酸浓度随培养时间变化不明显,波动范围基本维持在初始值(9.16 mmol/L)的20%左右;乳酸浓度在培养24 h和72 h时分别达到16.3 mmol/L(初始值的161.3%)和17.66 mmool/L(初始值的174.8%);乙酸浓度在36 h出现最大值30.15 mmol/L(初始值的277%),在60 h降到21.24 mmol/L(初始值的253%)后开始出现上升趋势,在84 h升高到27.5 mmol/L(初始值的195%)。
在CCSD不同深度的岩心样品中均发现一些好氧微生物存在迹象,对其生理性质和代谢进行了初步分析,结果表明,3910米深度以上样品中可能存在一定比例的耐热微生物,各个深度的样品中分离到的微生物中均有一定比例的寡营养微生物,这些是与岩心样品中寡营养环境相适应的。鉴于实验技术和方法所限,以及深部微生物生长的特殊习性,还不能完全排除潜在的地表微生物污染的可能性,因此只能得出地下不同深度微生物存在的初步证据,还不能得出完全肯定的结论,将作进一步研究来验证。
以来自瘤胃宏基因组BAC文库的一个具有维素素酶活性的阳性克隆为材料,经亚克隆获得具有CMC-Na酶活性的基因片段质粒。序列分析表明其插入片段与溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)H17c的end1(CAA35574)具有较高的相似性,包括完整的CD区、linker区和部分CBD区。
通过PCR方法,对酶基因的催化区(Catalytic domain,CD)及上游调控序列进行扩增,扩增产物被克隆到pGEM-T vector上进行测序,结果表明基因片段长为1256 bp,与来自纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)H17c的内切纤维素酶end1相似性最高,核酸相似性为84%,氨基酸相似性为86%。
根据测序结果设计引物,克隆了该基因的三个不同长度的DNA片段,分别构建到带有T7启动子的原核表达载体pET28a(+)上,转化到大肠杆菌(DE3)中,获得三株重组表达菌株,即P114B,NP122B和NP271B。内切葡聚糖酶活性测定结果表明:经IPTG诱导后,插入片段不含核糖体结合位点(RBS)序列但带有自身信号肽序列的NP122B表达的酶活力最高,其次是插入基因片段既不含RBS序列又去掉自身信号肽序列的NP271B,而插入片段带有自身RBS序列和信号肽序列的P114B酶活性最低,三个菌株的活性分别为11.67 IU/mL,7.18 IU/mL和1.18 IU/mL。
酶学性质分析表明,重组表达的内切葡聚糖酶最适作用温度为55℃,最适作用pH值为5.8。在40℃和45℃保温6 h酶活力维持在90%以上,但是在55℃保温1 h酶活力则完全丧失。在pn5.0-10.2条件下在40℃保温1 h,该酶可以维持80%以上的酶活力。该酶不具有纤维二糖水解酶(β-葡萄糖苷酶)活性,具有微弱的滤纸纤维素酶(FP酶)活性。