目的探讨体内维生素A(vitamin A, VA)水平对缺氧缺血脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage, HIBD)大鼠神经修复的影响。方法将84只7d龄wistar大鼠随机分为VA正常( VA normal, VAN),VA缺乏( VA deficiency, VAD)和假手术对照(control)组。按照本课题组常规方法建立VA正常和缺乏新生大鼠模型,按照经典Rice法HIBD造模。高效液相色谱法(HPLC)检测血清VA水平评估模型鼠体内VA营养水平。在修复中晚期测试神经功能损伤评分(mNSS),Morris水迷宫和穿梭箱评估神经认知功能,钙影像检测海马CA1区椎体神经元的NMDA诱导钙内流现象。在极期EdU新生细胞标记术评估VAD和VAN两组损伤后细胞新生的能力,Tunel染色评估脑组织细胞凋亡程度,Nissl染色评估VAD和VAN两组海马组织萎缩程度。流式细胞术分析缺氧缺糖损伤(OGD)的原代海马神经元的细胞凋亡和线粒体膜电位变化。进一步分析各组海马组织和原代海马神经元RA信号,TGF-β信号和线粒体凋亡通路分子的基因和蛋白水平差异。结果(1)整个实验期VAD、VAN和Control三组模型鼠血清VA水平分别控制在0.4~0.7μmol/L、0.7~1.1μmol/L、0.65~1.05μmol/L,符合实验要求。(2)功能学结果:术后7、14、21和28d神经功能损伤评分VAD组显著高于VAN组(P<0.05),control组评分显著低于其它两组(P<0.01)。Morris水迷宫测试VAD组平均潜伏时间在测试的2~5d显著长于VAN组(P<0.05),穿越平台次数显著低于VAN组(P<0.05),Control组平台平均潜伏时间在整个测试期均显著低于其它两组(P<0.05),穿越平台次数显著高于其它两组(P<0.01)。穿梭箱测试VAD组在测试2~5d天主动逃避率显著低于VAN组(P<0.05),未逃避率显著高于VAN组(P<0.05)。Control组主动逃避率显著高于其它两组(P<0.05),未逃避率显著低于其它两组(P<0.05)。VAD组海马CA1区椎体细胞的50μmol/LNMDA激发的钙震荡效应在HIBD损伤的急性期(术后3~14d)明显强于VAN组(P<0.05),而在修复的晚期(术后14~30d)则显著弱于VAN组(P<0.01)。提示体内VA水平正常可显著促进HIBD后神经功能恢复。(3)组织学结果:术后3d,大体形态可见VAD组的HIBD损伤侧(左侧半脑)明显萎缩重于VAN组,VAD组海马CA3部与皮层的间隙显著宽于VAN组,且海马体小于VAN组,在术后7d两组无明显差异。术后2d~7d,VAD组海马CA1、CA3、DG和顶叶皮层,颞叶皮层的EdU阳性细胞(红色荧光)显著少于VAN组,且海马的新生细胞主要出现在椎体细胞层,皮层主要区域在layer2~5区,且术后2d细胞新生明显多于7d。HIBD损伤后3dVAD组海马CA1、CA3、DG和顶叶皮层,颞叶皮层的细胞凋亡明显重于VAN组(黄箭头所示绿色荧光)。且两组的海马细胞凋亡主要存在于椎体细胞层,皮层凋亡主要出现在layer4~5。在损伤后7d凋亡也显著重于VAN组,而且凋亡的发生区也开始扩散,海马细胞凋亡在椎体层区和分子层区,皮层的layer2~5都可见明显的细胞凋亡。(4)基因蛋白结果:我们发现RARα的mRNA在HIBD损伤的极期到中期(术后3~14d)VAD组都显著高于VAN组(P<0.05),在修复中到晚期(术后14~28d)RARα的mRNA VAD组则显著低于VAN组(P<0.05),RARα是各RA受体表达的优势受体。进一步发现VAD组的神经元标志物NSE的mRNA在术后3d、14d都显著低于VAN组(P<0.01),神经胶质细胞标志物GFAP的mRNA在术后1、7、14d VAD组则显著低于VAN组(P<0.05),神经干细胞标志物Nestin的mRNA水平在术后3、7、14dVAD组显著低于VAN组(P<0.05),在术后7dVAD组GDNF表达显著低于VAN组(P<0.05),而TGF-β1、2在损伤后1~3dVAD组显著高于VAN组(P<0.01),7dVAD组显著低于VAN组(P<0.01)。于是我们检测HIBD的极期和中期细胞凋亡的信号通路在VAD和VAN两组间的差异,在术后1、7dVAD组的凋亡蛋白caspase-3mRNA水平显著高于VAN组,caspase-8在术后1、3、7d显著高于VAN组(P<0.05),线粒体凋亡通路的bax表达在术后1、3、7d显著高于VAN组(P<0.05),bak在术后1d显著高于VAN组(P<0.01),bid在7、14d显著高于VAN组(P<0.01),而线粒体凋亡通路中的抗凋亡分子bcl-2在术后7、14d显著低于VAN组(P<0.05)。以上内容提示体内VA正常促进HIBD神经组织功能修复的可能机制是因为RA信号作用于TGF-β信号进而影响线粒体凋亡级联信号通路而作用于神经细胞凋亡。(5) RA信号对OGD损伤海马神经元凋亡的影响:1~5μmol/LATRA处理的神经元OGD损伤后细胞凋亡率较其它浓度ATRA处理组明显更低(P<0.01)。进一步我们通过过表达RARα,沉默RARα来探讨是否RARα介导适宜RA信号抑制细胞凋亡,发现1μmol/LATRA处理的神经元OGD损伤后细胞凋亡率最低(P<0.01),而过表达RARα+1μmol/L ATRA组,沉默RARα+1μmol/L ATRA组凋亡率最高(P<0.05)。1μmol/LATRA处理的神经元OGD损伤后线粒体膜电位异常率最低(P<0.05),而且沉默+1μmol/L ATRA显著低于沉默组(P<0.05),过表达+1μmol/L ATRA组显著高于过表达组(P<0.01),这种类似于一种回归效应。提示RA信号可能主要作用于线粒体凋亡通路,且存在一个适宜的RA信号在抑制线粒体凋亡。(6)可能机制:我们用不同浓度ATRA处理OGD损伤的原代海马神经元发现RARα的mRNA水平与ATRA浓度存在剂量相关性,ATRA浓度越高则RARα的mRNA水平越高。进一步发现过表达RARα+1μmol/L ATRA组和沉默RARα+1μmol/L ATRA组线粒体凋亡通路的caspase-3、caspase-8、Bid、bax和bak的mRNA水平或蛋白水平显著高于1μmol/LATRA处理组和OGD对照组(P<0.01),而bax的mRNA水平在1μmol/LATRA处理组显著低于OGD对照组(P<0.01),抗凋亡分子bcl-2则显著高于OGD对照组(P<0.01),过表达RARα+1μmol/L ATRA组bcl-2水平显著高于沉默组和OGD对照组(P<0.01)。这都提示RA信号的抗凋亡作用通过线粒体凋亡通路实现。过表达和沉默组的TGF-β表达都显著低于1μmol/L ATRA处理组(P<0.01),而OGD组TGF-β表达最高(P<0.01),1μmol/L ATRA处理组处于中间水平。1μmol/L ATRA处理组的GDNF表达显著高于沉默组和OGD组(P<0.01),且过表达组最高(P<0.01),但同时过表达组的凋亡信号分子表达也最高,以上结果提示RA信号抗凋亡可能是通过RARα影响GDNF,TGF-β信号从而影响线粒体凋亡通路,而同时RA信号还通过其他通路影响着凋亡。结论HIBD损伤的机体处于适宜VA营养水平时可显著促进神经功能的修复。可能的病理生理机制是适宜VA水平促进极期的皮层神经细胞新生和抑制细胞凋亡,分子机制是适宜RA信号促进适宜TGF-β信号和GDNF进而抑制bax表达上调bcl-2表达,从而抑制线粒体凋亡通路,最终抑制缺血缺氧损伤所致的细胞凋亡。这提示体内维持正常的VA水平对HIBD修复有着良好的促进作用。目的探讨体内维生素A(vitamin A, VA)水平对大鼠骨髓间充质干细胞(rat mesenchymal stem cell, rMSCs)移植治疗缺氧缺血脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage, HIBD)大鼠神经修复的影响。方法将144只7d龄wistar大鼠随机分为VA正常移植细胞组(VANM),VA缺乏移植细胞组(VADM)和HIBD对照组;按照本课题组常规方法建立VA正常和缺乏新生大鼠模型,按照经典Rice法HIBD造模,损伤24h后每只大鼠腹腔移植1*106rMSCs,高效液相色谱法检测血清VA水平,在修复中晚期测试神经功能损伤评分(mNSS)、Morris水迷宫和穿梭箱评估神经认知功能,钙影像分析海马CA1区椎体神经元的NMDA诱导的钙内流现象;TTC染色评估损伤后脑组织梗死面积,在极期用EdU新生细胞标记术评估细胞新生的能力,通过Tunel染色评估细胞凋亡;流式细胞术检测缺氧缺糖损伤(OGD)的原代海马神经元细胞凋亡和线粒体膜电位变化;进一步分析海马组织和原代海马神经元RA信号,TGF-β信号和线粒体凋亡通路分子的基因和蛋白水平。结果(1)整个实验期VADM、VANM和HIBD三组模型鼠血清VA水平分别控制在0.4~0.8μmol/L、0.7~1.3μmol/L、0.6~1.1μmol/L,符合实验要求。(2)功能学结果:术后7、14、21和28d神经功能损伤评分VADM组显著高于VANM组(P<0.05),HIBD组评分显著高于其它两组(P<0.05)。术后23d开始的Morris水迷宫测试VADM组的寻找平台平均潜伏时间和寻找平台距离在测试的2~5d显著长于VANM组(P<0.05),穿越平台次数显著低于VANM组(P<0.01),HIBD组的寻找平台平均潜伏时间和寻找平台距离在整个测试期均显著长于其它两组(P<0.05),穿越平台次数显著少于其它两组(P<0.01)。术后28d开始的穿梭箱测试VADM组在测试期2~5d主动逃避率显著低于VANM组(P<0.05),在4~5d未逃避率显著高于VANM组(P<0.05),HIBD组主动逃避率显著低于其它两组(P<0.05),未逃避率显著高于其它两组(P<0.05)。VADM组海马CA1区椎体细胞的50μmol/LNMDA激发的钙震荡效应在HIBD损伤的急性期(术后3~7d)明显强于VANM组(P<0.05),而在修复的晚期(术后14~30d)则显著弱于VANM组(P<0.01)。以上内容提示体内VA正常可显著促进rMSCs移植治疗HIBD后的神经功能恢复。(3)组织学结果:术后7d大体形态可见VADM组的损伤侧(左侧半脑)梗死面积显著大于VANM组(P<0.05),但VADM和VANM梗死面积均显著小于HIBD组(P<0.05)。rMSCs移植后2、7d我们评估rMSCs在脑内定植,在移植rMSCs两组仅在皮层区发现有rMSCs的定植(绿色荧光),而在海马区未发现有rMSCs的定植,并且在颞叶和顶叶皮层,移植后2d和7dVANM组rMSCs定植要显著多于VADM组(P<0.05)。移植后2d、7d,VADM组海马CA1、CA3、DG和顶叶皮层,颞叶皮层的新生细胞(EdU阳性细胞,红色荧光)显著少于VANM组,且海马的新生细胞主要出现在椎体细胞层,皮层主要区域在layer2~5区,移植后2dEdU阳性细胞显著多于7d。rMSCs移植后2dVADM组海马CA1、CA3、DG和顶叶皮层,颞叶皮层的细胞凋亡明显重于VANM组(黄箭头所示绿色荧光,且两组的海马细胞凋亡主要存在于椎体细胞层和分子层区,皮层凋亡主要出现在layer3~5,在移植后7dVADM凋亡也显著重于VANM组,且凋亡的发生区较2d开始缩小,海马细胞凋亡集中于椎体层区,皮层的layer2~5都可见明显的细胞凋亡。以上内容提示体内VA缺乏可显著抑制rMSCs移植治疗HIBD后的神经组织修复。(4)基因和蛋白表达结果:发现RARα的mRNA和蛋白水平在HIBD损伤的极期(术后3~7d)VADM组都显著高于VANM组(P<0.05),在修复中到晚期(术后14~28d)RARα的mRNA和蛋白水平VADM组则显著低于VANM组(P<0.01),RARα和RXRγ受体是各RA受体表达的优势受体。进一步发现VADM组的神经元标志物NSE的mRNA和蛋白水平在HIBD术后14d都显著低于VANM组(P<0.05),神经胶质细胞标志物GFAP的mRNA和蛋白水平在21~30d VADM组则显著低于VANM组(P<0.01),神经干细胞标志物Nestin的mRNA和蛋白水平在HIBD术后3、14dVADM组显著低于VANM组(P<0.01),在损伤后3、7、14dVADM组GDNF表达显著低于VANM组(P<0.05),而TGF-β1在损伤后3~7dVADM组显著高于VANM组(P<0.01),7~14dVADM组显著低于VANM组(P<0.01)。进一步检测HIBD的极期和中期细胞凋亡的信号通路在VADM和VANM两组间的差异,在术后7dVADM组的凋亡蛋白caspase-3、bid、bax和bak的mRNA或蛋白水平显著高于VANM组(P<0.05), caspase-8的mRNA和蛋白水平在术后3、7、14d显著高于VANM组(P<0.05),而线粒体凋亡通路中的抗凋亡分子bcl-2的mRNA和蛋白水平在术后7、14d显著低于VANM组(P<0.05)。以上内容提示体内VA正常促进rMSCs移植治疗HIBD神经组织功能修复的可能机制是因为RA信号作用于TGF-β信号进而影响线粒体凋亡级联信号通路作用于神经细胞凋亡。(5) ATRA联合rMSCs培养对OGD损伤原代海马神经元凋亡影响:rMSCs处理各组凋亡率显著低于OGD组,rMSCs+1μmol/LATRA处理的神经元OGD损伤后细胞凋亡率较其它处理组明显更低(P<0.05)。rMSCs+1μmol/LATRA处理的神经元OGD损伤后线粒体膜电位异常率较其它处理组更低(P<0.05),而高浓度ATRA处理组线粒体膜电位异常率与OGD组无差异。以上结果提示适度RA刺激可显著促进rMSCs的抗凋亡作用,而高浓度可能抵消此效应。(6)可能机制:发现RARα的mRNA和蛋白水平与ATRA浓度存在剂量相关递增性,ATRA浓度越高则RARα的mRNA和蛋白水平越高,rMSCs联合1μmol/LATRA处理组RARα表达处于中间水平,而且对照组的RARα表达最低(P<0.01)。神经元标志蛋白NSE的表达对照组最高(P<0.01),rMSCs处理各组NSE表达显著高于OGD组(P<0.05),其中rMSCs联合1μmol/LATRA处理组NSE表达较其他损伤组表达最高(P<0.01),OGD组NSE表达则最低(P<0.05)。rMSCs处理各组的GDNF基因和蛋白表达显著高于OGD组(P<0.01),其中rMSCs联合1μmol/LATRA处理组GDNF表达较其他组表达最高(P<0.01)。TGF-β1、2的表达rMSCs处理后较对照组升高,但低于OGD组,rMSCs联合1μmol/LATRA处理组TGF-β1、2的表达则处于中间水平(P<0.05)。我们深入检测细胞线粒体凋亡信号通路的关键分子表达水平变化, rMSCs处理各组能显著降低凋亡信号分子caspase-3、caspase-8、bid、bax、bak的表达(P<0.01),而且rMSCs联合1μmol/LATRA处理组表达更低(P<0.05),而高浓度和无ATRA处理组表达则相对高于rMSCs联合1μmol/LATRA处理组;而rMSCs处理各组的抗凋亡分子bcl-2的表达显著高于OGD组,其中rMSCs联合1μmol/LATRA处理组表达最高(P<0.01),而高浓度和无ATRA处理组表达则相对低于rMSCs联合1μmol/LATRA处理组。以上内容提示OGD损伤的神经元,rMSCs处理可显著抗凋亡,联合不同浓度ATRA刺激,发现在较低浓度时可促进rMSCs抗凋亡,高浓度或无RA刺激则抑制rMSCs抗凋亡。提示有着一个最适的RA信号丰度联合rMSCs发挥最强的抗凋亡作用,可能的机制是通过适宜的RA信号丰度影响GDNF,TGF-β信号进而直接影响线粒体凋亡,另外适宜的RA信号也导致TGF-β信号维持在一适宜的水平进而通过促进rMSCs旁分泌效应影响线粒体凋亡信号通路。结论机体处于适宜VA营养水平时可显著促进rMSCs移植治疗HIBD,可能的病理机制是适宜VA水平本身促进极期的神经细胞新生和抑制脑组织梗死萎缩并叠加对rMSCs定植和活性的促进进而影响细胞新生和组织梗死萎缩,其分子机制是适宜RA信号联合rMSCs的旁分泌效应与适宜TGF-β信号和GDNF互为影响进而抑制线粒体凋亡通路级联表达并上调bcl-2表达从而抑制线粒体凋亡通路最终抑制缺氧缺血脑损伤所致的细胞凋亡。这提示体内维持体外正常的VA水平内环境对rMSCs移植治疗HIBD修复有着良好的促进作用。