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研究目的在本课题组前期研究基础上,进一步明确小檗碱对视网膜光损伤的治疗效应,探讨嘌呤信号P2X7R是否是小檗碱改善视网膜光损伤的重要环节,并从P2X7R/NLRP3信号通路,深入揭示小檗碱抗视网膜光损伤的作用机制。研究方法第一部分将C57BL/6J小鼠分为正常（Ctrl）组、模型（LD）组,LD组根据不同光照时间（1天、3天、5天、7天）分LD 1d、LD 3d、LD 5d、LD 7d组。通过30k lux白色LED冷光灯每日照射（4h）小鼠诱导视网膜光损伤。采用HE染色检测小鼠视网膜形态,根据视网膜形态选择最佳光照时间,按照此光照时间,采用TUNEL检测细胞凋亡情况、Western Blot检测视网膜炎症因子（TNF-α、IL-1β）表达,免疫荧光检测视网膜内GFAP表达,进一步评估视网膜光损伤后细胞损伤及炎性反应。将C57BL/6J小鼠分为正常（Ctrl）组、模型（LD）组、PBS灌胃（PBS）组、小檗碱灌胃（BBR）组,除正常组其余三组根据上述实验确定的光照条件进行造模。采用HE及TUNLEL检测视网膜形态与细胞凋亡情况、Western Blot检测TNF-α、IL-1β表达,采用免疫荧光检测视网膜内GFAP、NeuN、c-Fos表达,评估小檗碱治疗效应。第二部分将C57BL/6J小鼠分为Ctrl组、LD组、PBS组、BBR组,除正常组其余三组均进行光照。采用Western Blot及免疫荧光检测P2X7R蛋白表达,并检测GFAP/P2X7、NeuN/P2X7荧光共标记情况,探讨小檗碱是否通过抑制P2X7R发挥抗视网膜光损伤作用,能否抑制Müller细胞释放P2X7R介导的神经节细胞死亡。并观察PBS及BBR组光照结束后一周视网膜内P2X7R蛋白表达,评价小檗碱在视网膜光损伤模型中的动态变化趋势。第三部分将 C57BL/6J 小鼠分为 Ctrl 组、PBS 组、BBR 组、A438079 组、BzATP 组、BzATP+BBR组,PBS、BzATP、A438079均通过玻璃体注射途径给药。将C57BL/6J背景小鼠结合P2X7R基因敲除技术,进行饲养繁殖,选择野生型及基因敲除型小鼠进行分组:野生型对照（WT-Ctrl）组、野生型模型（WT-LD）组、野生型药物（WT-BBR）组、基因敲除型模型（P2X7 KO-LD）组、基因敲除型药物（P2X7 KO-BBR）组。除Ctrl、WT-Ctrl组其余组均进行光照。采用Western Blot检测P2X7R蛋白表达,HE及TUNEL检测视网膜形态及细胞凋亡,进一步验证小檗碱是否通过抑制视网膜内P2X7R水平而发挥抗视网膜光损伤作用。第四部分将C57BL/6J小鼠分为Ctrl组、LD组、PBS组、BBR组。将C57BL/6J背景结合P2X7R基因敲除技术小鼠分为:WT-Ctrl组、WT-LD组、WT-BBR组、P2X7 KO-LD组、P2X7 KO-BBR。除Ctrl、WT-Ctrl组其余组均进行光照。采用Western Blot及免疫组化检测NLRP3/IL-1 β通路相关蛋白水平,探讨NLRP3/IL-1β是否介导小檗碱抗视网膜光损伤作用,及P2X7R基因敲除条件下小檗碱对P2X7/NLRP3的调控作用。研究结果第一部分,在白色LED冷光灯（30k lux,4h）光照条件下,根据小鼠视网网膜外核层光感受器细胞损伤情况,确定本实验的模型方法:LED白色冷光灯照射7天、每日连续光照4小时,接下来的研究按此方法进行。与Ctrl组比较,LD组小鼠视网膜外核层显著变薄,且TNF-α、IL-1 β及GFAP表达增强,表明视网膜光损伤模型成功建立。与Ctrl组比较,PBS组视网膜外核层变薄,阳性细胞凋亡数及c-Fos表达增加,TNF-α、IL-1 β、GFAP表达增强,NeuN表达减少,差异有统计学意义（p＜0.05）,LD与PBS组间比较无统计学差异,与PBS组比较,BBR组视网膜内外核层厚度增加,阳性细胞凋亡数及c-Fos表达减少,TNF-α、IL-1 β、GFAP表达减少,NeuN表达增加,差异有统计学意义（p＜0.05）,表明小檗碱有效缓解视网膜光损伤。第二部分,LD及PBS组视网膜内P2X7R蛋白表达较Ctrl组升高,与LD及PBS组比较,BBR组视网膜内P2X7R蛋白表达减少,差异有统计学意义（p＜0.05）。与Ctrl组比较,LD及PBS组视网膜内GFAP/P2X7、NeuN/P2X7荧光共标记增加,与LD及PBS组比较,BBR组视网膜内GFAP/P2X7、NeuN/P2X7荧光共标记减少,表明小檗碱调控P2X7R抗视网膜光损伤。光照结束后一周,PBS及BBR组小鼠视网膜内P2X7R蛋白水平接近Ctrl组,组间差异无统计学意义（p＞0.05）,表明小檗碱对P2X7R的调控作用随着P2X7R水平下调而减弱。第三部分,BzATP增加视网膜内P2X7R表达,减少外核层厚度,增加细胞凋亡,P2X7R拮抗剂及BBR抑制视网膜内P2X7R表达,增加外核层厚度,减少细胞凋亡,而BBR的保护作用被P2X7R激动剂BzATP削弱。与WT-LD组比较,P2X7 KO-LD、P2X7 KO-BBR及WT-BBR组视网膜外核层厚度明显增加,细胞凋亡减少,差异有统计学意义（p＜0.05）,与P2X7 KO-BBR组比较,WT-BBR组视网膜外核层厚度降低,细胞凋亡较多,差异有统计学意义（p＜0.05）,进一步验证P2X7R介导小檗碱抗视网膜光损伤。第四部分,与Ctrl组比较,LD及PBS组小鼠视网膜内NLRP3/IL-1β相关蛋白水平升高,与LD及PBS组比较,BBR组NLRP3/IL-1β相关蛋白水平降低,差异有统计学意义（p＜0.05）。与WT-Ctrl组比较,WT-LD组视网膜内NLRP3、IL-1β、Caspase-1 蛋白表达增加,与 WT-LD 组比较,P2X7R KO-LD 及 P2X7 KO-BBR组小鼠视网膜内NLRP3、IL-1β、Caspase-1蛋白表达减少,差异有统计学意义（p＜0.05）,表明小檗碱通过P2X7/NLRP3途径抗视网膜光损伤。研究结论1.经灌胃给药,小檗碱可缓解AMD模型小鼠视网膜光损伤,保护视网膜外核层形态结构,减少神经元细胞丢失及细胞凋亡。2.小檗碱可抑制光损伤后视网膜内炎性因子TNF-α、IL-1β释放,并抑制胶质细胞增殖。3.视网膜光损伤过程中,嘌呤信号P2X7R过度表达,在视网膜光损伤模型中与光感受器、神经元细胞损伤密切相关,小檗碱可下调视网膜内P2X7R蛋白水平,抑制P2X7R过度激活,从而抑制视网膜损伤,防止AMD发生发展。4.视网膜光损伤过程中,P2X7R与NLRP3/IL-1 β密切相关,小檗碱靶向P2X7R,降低NLRP3/IL-1 β相关蛋白水平,抑制P2X7R激活导致的炎性反应,因此,小檗碱抗视网膜光损伤效应一定程度依赖于P2X7/NLRP3途径。