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头孢氨苄(Cephalexin)是第一代可用于口服的头孢类抗生素,具有抗菌谱广、杀菌力强、耐酸、胃肠吸收好等优点,该药被列入我国和其他各国基本药物目录中。与传统的化学法相比,酶法合成头孢氨苄具有反应条件温和,工艺操作简单,无需基团保护,清洁安全等优点。目前国内外均使用固定化青霉素G酰化酶(Penicillin G acylase,PGA)合成头孢氨苄。固定化PGA价格昂贵,如何最大程度地使固定化PGA酶活保持稳定,从而最大程度地提高固定化PGA的重复使用次数,是当前酶法合成头孢氨苄生产中亟待解决的问题之一。本课题对酶法合成头孢氨苄时造成青霉素酰化酶酶活降低的因素,如何改善固定化青霉素酰化酶稳定性,以及失活固定化PGA的再生进行了研究。造成青霉素酰化酶酶活降低的因素研究。7-ADCA和PGM对固定化PGA有很强的抑制作用,而且PGM的抑制作用几乎与其浓度无关;头孢氨苄对固定化PGA具有产物抑制作用,而且这种抑制作用与其浓度呈正相关;固定化PGA在反应温度≤30℃,酶反应液pH值为6.5时,固定化PGA酶活稳定性最好;磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液可显著提高固定化PGA酶活稳定性。改善固定化青霉素酰化酶稳定性的研究。研究了金属离子、表面活性剂、糖类、氨基酸以及醇类对固定化PGA酶活的影响。Ca2+对固定化PGA的有激活作用,使其酶活提高了10.65%。添加果糖、聚乙烯醇和异丙醇可显著提高固定化PGA酶活。赖氨酸和甘氨酸对固定化PGA有很大的激活作用,使其酶活增加了34%以上;而色氨酸和叶酸有明显的抑制作用。异丙醇、L-赖氨酸、Ca2+、聚乙烯醇复合加入到头孢氨苄反应液时,它们之间没有协同作用。酶法合成头孢氨苄时添加0.5%异丙醇,使得固定化PGA重复使用次数达16次,比未添加的对照相比提高45.45%,固定化PGA的酶活稳定性获得了非常显著的改善。失活固定化PGA进行了再生研究。去离子水洗涤和酸水(pH6)洗涤对失活固定化PGA没有再生作用,而碱水(pH8)洗涤具有再生作用。30℃下用pH8碱水洗涤60 min,使其酶活提高5.7%。超声处理(频率28 KHz,15 min)使得失活固定化PGA酶活提高了5.67%。展开-再折叠再生法对失活固定化PGA的再生无效。介质直接再生法(30%乙二醇+100 mM7-ADCA)对失活固定化PGA具有再生效果,使其酶活提高13.81%。失活固定化PGA的适宜再生方法为:首先用30%乙二醇-100mM7-ADCA溶液浸泡60 min,然后用碱水洗涤60 min,最后用28 KHz超声处理15min,使失活固定化PGA酶活力恢复率达77.75%,再生效果良好。