研究背景血管新生是新生血管从已有的毛细血管网络中萌发形成的过程,它不仅广泛参与了人体内多种生理反应,在动脉粥样硬化斑块的进展和肿瘤的生长中也发挥着关键作用。除了斑块内过量的胆固醇沉积、变薄的纤维帽和加重的炎症反应以外,斑块内血管新生(intraplaque angiogenesis,IPA)和斑块内出血(intraplaque hemorrhage,IPH)在促进动脉粥样硬化斑块的进展和斑块不稳定中发挥至关重要的作用。IPA是由动脉外膜层的滋养血管长入动脉粥样硬化病变底部形成的新生血管,能运输细胞和可溶性成分,如红细胞、炎症细胞和脂质/脂蛋白到血管壁。IPA中的血管内皮细胞是不成熟且极其脆弱的,因此,血管内的红细胞、白细胞很容易漏出,导致斑块内压力增加从而造成反复地斑块内出血。同时,因为白细胞增多而导致斑块内炎症反应加剧,进而发生斑块破裂。IPA是由浸润的炎症细胞释放各种细胞因子和生长因子共同调节的。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是内源性升压物质中最强的血管活性物质之一,它不仅参与血压和血管稳态的适应性变化,还可起到类似于生长因子的作用,还能促进斑块内血管新生,加速动脉粥样硬化的进展,最终导致斑块破裂,中风和心肌梗死等恶性心血管事件的发生。AngⅡ通过和血管紧张素Ⅱ 1型受体(AT1R)结合,激活多种细胞内信号转导途径,已阐明的信号途径有受体酪氨酸激酶(EGFR,PDGFR,胰岛素受体)和非受体酪氨酸激酶[c-Src家族激酶,粘附激酶家族(focal adhesion kinase,FAK)和Janus激酶家族(Janus kinases,JAK)]。JAK2/STAT3信号通路的持续活化与AngⅡ介导的表型转换的维持有关,如AngⅡ诱导的血管平滑肌的生长、迁移和重构以及心肌肥厚。JAK-STAT信号通路是一种应激反应的信号级联,它能将细胞表面受体接受到的信号刺激逐级扩大,并最终传至细胞核内,进而调节相关基因的表达。信号转导子和转录激活子3(signal transducers and activators of transcription,STAT3)是信号转导与转录家族因子的重要成员之一,一旦被AngⅡ激活后可诱导与细胞增殖、分化、生存、凋亡密切相关基因的异常高表达。STAT3信号通路与血管生成的关系已在肿瘤发生过程中得到研究,但关于其在动脉粥样硬化斑块中的作用的研究较少。近年来,非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)发展十分迅速,microRNA(miRNA)是极具代表的ncRNA,能够参与细胞发育、细胞代谢、细胞衰老及细胞死亡等重大生命活动事件。miR-21最初是在癌细胞中被识别的,并作为一种关键的致癌因子促进了癌细胞增殖和肿瘤转移。既往研究表明,miR-21能通过下调其靶基因(TIMP3、PTEN、SMAD7)从而促进内皮细胞增殖、迁移和血管新生。AngⅡ也可以在体外和体内调节miRNA表达谱。虽然其潜在的分子机制尚未完全阐明,但具有促血管新生能力的miR-21被认为是介导AngⅡ发挥作用的内在靶点。此外,在其他的细胞类型和疾病模型中,比如肾细胞和慢性淋巴细胞白血病中,已有STAT3信号通路参与启动miR-21的表达的研究报道。然而,STAT3/miR-21通路是否参与AngⅡ诱导的血管新生还需要进一步证实。因此,在本研究中,我们首先探讨了AngⅡ对人微血管内皮细胞(human microvascular endothelial cells,HMECs)的促血管新生作用,紧接着我们探究了AngⅡ能否诱导HMECs中STAT3磷酸化以及上调miR-21的表达。此外,我们从体内和体外两方面评估了STAT3/miR-21调节对AngⅡ诱导的血管新生的影响,并通过检测STAT3与miR-21特异性启动子位点的结合来分析STAT3与miR-21的相互作用。此外,我们还对miR-21直接的作用靶点进行了研究。在本研究中,我们着重研究AngⅡ能否活化STAT3信号通路,上调miR-21的表达,改变内皮细胞中靶基因的水平进而产生明显的促血管新生效应。通过本研究,将初步阐明miR-21在AngⅡ促进血管新生中的作用和机制,并为动脉粥样硬化斑块内血管新生的防治提供新的策略和实验依据。研究内容1.培养人微血管内皮细胞(human microvascular endothelial cells,HMECs),磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)作为空白对照,利用CCK8法,EdU增殖试验检测AngⅡ对细胞增殖的影响;划痕实验检测AngⅡ对细胞迁移能力的影响;基质胶管腔形成实验检测AngⅡ对HMECs体外成管能力的影响。2.培养HMECs,PBS作为空白对照。实时定量PCR检测AngⅡ对HMECs中微小RNA(microRNA-21,miR-21)表达的影响。在HMECs中转染miR-21核酸模拟物(miR-21 mimic)、miR-21抑制剂(miR-21 inhibitor)或相应的对照(miR-21 mimic NC,miR-21 inhibitor NC),在改变HMECs中miR-21的表达后,采用CCK8法、EdU实验、划痕实验、基质胶管腔形成实验检测其对AngⅡ诱导的HMECs的增殖,迁移及成管能力的影响。Western Blot检测在AngⅡ处理后HMECs中p-STAT3,t-STAT3以及PTEN的蛋白表达水平。同时采用STAT3的磷酸化抑制剂Stattic干扰p-STAT3的活性,研究p-STAT3对AngⅡ诱导的HMECs增殖,迁移及成管能力的影响。采用生物信息学分析miR-21启动子区域与转录因子STAT3的结合情况,并预测其中的评分较高的功能性调节性位点。染色质免疫共沉淀联合PCR(CHIP-PCR)实验验证miR-21与p-STAT3的直接结合。双荧光素报告基因实验检测STAT3与miR-21的启动子区域特定的结合位点。双荧光素报告基因实验检测miR-21与PTEN mRNA的3’UTR区域的结合情况。3.采用6-8周龄的雄性C57BL/6J小鼠,探究STAT3磷酸化抑制剂Stattic及miR-21拮抗剂对AngⅡ诱导的小鼠体内血管新生的影响。研究结果1.AngⅡ在体外能显著增强血管新生作用。(1)与对照组相比,AngⅡ能显著增强HMEC的增殖能力,而在1000 nM的浓度下几乎丧失了其诱导作用;(2)与对照组相比,AngⅡ能促进HMEC的迁移,且其迁移能力在处理24小时的100 nM组达到最大;(3)与对照组相比,经10 nM和100 nM的AngⅡ处理的HMECs体外成管能力显著增加,表现为增加的闭合的毛细管数量以及长度。2.AngⅡ在体外促进血管新生的机制研究。(1)AngⅡ能显著促进HMECs表达miR-21,同时AngⅡ能增强miR-21上游重要的转录因子STAT3蛋白的磷酸化活性;(2)Stattic(STAT3在Tyr705位点的特异性磷酸化抑制剂)和miR-21 inhibitior可以明显抑制AngⅡ对HMECs的促增殖、促迁移和促成管作用;(3)生物信息学分析提示STAT3是能启动hsa-miR-21-5p表达的重要转录因子之一,AngⅡ能将STAT3活化,生成的p-STAT3能与miR-21进行稳定结合;(4)生物信息学预测提示在miR-21的上游启动子区域内存在与STAT3转录因子结合的有作用的功能性调节位点,STAT3能与miR-21在其上游启动子区域内的P1(-3352,-3340),P2(-4365,-4355)以及P3(-4528,-4516)位点进行特异性结合,随后启动miR-21的表达;(5)生物信息学分析提示PTEN可能是miR-21下游的作用靶点。AngⅡ能显著降低miR-21下游靶基因PTEN蛋白的表达水平,而在使用STAT3磷酸化抑制剂Stattic或miR-21拮抗剂miR-21 antagomir后,PTEN蛋白的表达能在一定程度上得到回升。miR-21能与PTEN mRNA的3’UTR区域进行稳定结合并下调其蛋白表达。3.AngⅡ促进体内血管新生的作用和机制(1)AngⅡ能在体内发挥促血管新生作用。(2)STAT3/miR-21信号通路参与了AngⅡ诱导的体内血管新生。加入Stattic或miR-21拮抗剂后,基质胶栓中AngⅡ的促血管新生反应发生了逆转。研究结论AngⅡ在体内外均有显著的促进血管新生的作用。同时,AngⅡ促进HMEC增殖,迁移和血管新生的能力在100 nM浓度下达到最大,而在1000 nM的浓度下几乎丧失了其诱导作用。在机制方面,AngⅡ能通过活化STAT3增加miR-21的表达,从而下调miR-21靶基因PTEN的表达水平,增强HMEC的增殖、迁移能力,最终促进血管新生。本研究阐述了AngⅡ参与血管新生的一种新的机制,以期为减缓动脉粥样硬化的进程以及抑制动脉粥样硬化斑块内血管新生提供治疗策略。