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背景宫腔粘连(intrauterine adhesions,IUAs)又称为 Asherman 综合征,该疾病可同时存在宫腔瘢痕形成或子宫内膜菲薄。临床表现无特异性,主要为月经稀发、不孕及一些妊娠并发症。目前,宫腔粘连采用的临床干预措施主要包括宫腔镜下粘连分离术、术后放置球囊并给予防粘连药物、口服雌激素治疗等。传统治疗方法存在临床局限,无法促进子宫内膜再生、提高生育能力。近年来研究发现人子宫内膜间充质干细胞(endometrial mesenchymal stem cells,enMSCs)具有来源广、低免疫原性、无成瘤性、无伦理学争议和可自体移植等优点,并且国内外大量研究已经证实通过宫腔原位注射方式移植enMSCs对修复子宫内膜有一定疗效,但这种移植方式间充质干细胞局部定植率低,而间充质干细胞/支架复合物(即组织工程子宫内膜)宫腔原位移植有助于间充质干细胞在局部损伤部位的粘附,大大提高了间充质干细胞的移植效率。聚N-异丙基丙烯酰胺(Poly-N-isopropylacrylamide,PNIPAM)水凝胶作为一种新型温敏型生物支架,优点在于细胞相容性好,可负载多种生物活性因子,可以随着温度变化进行溶胶-凝胶相转化,其相转变温度为32℃,当温度高于32℃由液体状变为凝胶状,便于细胞在宫腔内的定植;当温度低于32℃由凝胶状变为液体状,便于细胞注射操作,此过程可逆,为细胞的体外培养和体内移植提供了极大便利。现国内外尚未见用温敏型水凝胶构建组织工程子宫内膜的报道。因此,本研究拟以聚N-异丙基丙烯酰胺温敏水凝胶为支架构建组织工程子宫内膜,为提高自体子宫内膜干细胞移植治疗宫腔粘连所致薄型子宫内膜的疗效奠定基础。目的构建以人子宫内膜间充质干细胞为种子细胞、以聚N-异丙基丙烯酰胺温敏水凝胶为支架的组织工程子宫内膜,从而提高自体子宫内膜间充质干细胞移植治疗宫腔粘连所致薄型子宫内膜的成功率。方法1.采用组织块培养法从宫腔粘连患者的子宫内膜中分离enMSCs并于体外进行培养、鉴定;2.将体外扩增的enMSCs与PNIPAM温敏水凝胶共培养,利用流式细胞术和活死细胞鉴定试剂盒鉴定PNIPAM水凝胶对enMSCs的细胞毒性;3.将enMSCs与不同浓度PNIPAM温敏水凝胶共培养,寻找适合enMSCs体外培养的最佳温敏水凝胶浓度,应用CCK-8、活死细胞染色鉴定、流式细胞术等方法对温敏型水凝胶为支架构建的组织工程子宫内膜进行鉴定。结果1.应用组织块培养法成功从宫腔粘连患者子宫内膜中分离培养出enMSCs,约2周原代细胞达到80%-90%融合,细胞呈长梭形,辐射状生长,传代后可稳定生长。流式检测结果显示,enMSCs表现出CD44、CD73、CD90、CD105阳性,CD34、CD45、CD11b、CD19 及 HLA-DR 阴性;2.活死细胞鉴定显示:enMSCs在2.5%PNIPAM温敏水凝胶中细胞形态最佳,呈细胞团样生长;流式细胞术检测显示:enMSCs在温敏型水凝胶中培养第4天时细胞存活率达95%以上,且该水凝胶不影响细胞表面标记物的表达;3.CCK-8结果显示,2D培养组细胞在1～4天呈对数增长,4～7天进入平台期;3D培养组细胞7天内增殖效果不明显;活死细胞鉴定显示:enMSCs在PNIPAM温敏水凝胶中培养第14天,细胞较2D培养组存活良好。结论聚N-异丙基丙烯酰胺水凝胶具有温度敏感特性和良好的细胞相容性,对人子宫内膜间充质干细胞的细胞毒性较低,以该温敏型水凝胶为支架构建的组织工程子宫内膜有利于延长子宫内膜间充质干细胞的生存时间。