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种植体表面形貌可以有效地改善骨整合,其中巨噬细胞在成骨过程中发挥着不可或缺的作用。巨噬细胞在不同的局部微环境中以不同的形式极化（促炎型M1或抗炎型M2）。极化方向决定骨整合效果,即M1极化则引发炎症反应和促进骨组织吸收,M2极化有利于炎症消退和骨组织形成。本课题组前期研究发现纯钛表面形成的微纳米结构可以有效的促进巨噬细胞的表型及功能的变化。但是这种微纳米结构如何调控巨噬细胞极化功能,其作用机制尚不明确。本研究针对该问题,从细胞自噬的角度,系统性探索了微纳米形貌诱导巨噬细胞M2极化的调控机制。同时我们还对微纳米形貌进行了化学药物修饰,将地塞米松加载在微纳米形貌表面增强诱导巨噬细胞M2型极化功能,改善成骨微环境,促进间充质干细胞的成骨分化,为改善种植体骨整合提供新思路。本研究的主要内容为:首先,通过酸蚀和阳极氧化在纯钛表面构建不同的微纳米形貌。检测巨噬细胞中极化相关基因和蛋白质的表达水平,筛选出可诱导巨噬细胞M2极化的NT-30微纳米形貌;其次,采用分子生物学方法,研究NT-30微纳米形貌调控巨噬细胞M2极化的相关分子机制;最后合成负载地塞米松（DEX）的介孔二氧化硅纳米粒子（MSN）,通过电泳沉积（EPD）沉积在NT-30表面,检测试样促M2极化能力,并通过与小鼠原代骨髓间充质干细胞（BMSC）间接共培养,评估BMSC的成骨分化情况。本研究初步探索了材料表面形貌介导巨噬细胞极化的分子机制,为我们定向调控巨噬细胞极化方向提供了新靶点,为研制新型靶向药物及设计靶向生物材料提供了新思路;并针对材料表面形貌优化做了一点尝试,为研发抑炎且促进骨生成的骨生物材料提供了新方法。研究目的1.观察不同微纳米形貌对小鼠巨噬细胞系RAW264.7生物学行为的影响2.探索微纳米形貌诱导小鼠巨噬细胞系RAW264.7发生M2型极化的分子机制,为指导材料表面的优化设计提供理论依据3.通过形貌及化学药物相结合,共同调控巨噬细胞M2极化来增强不同形貌表面成骨作用研究方法1.采用酸蚀及阳极氧化的方法构建出含不同管径TiO2纳米管的微纳米形貌,分别标记为NT-30、NT-100,同时设置对照组P组。通过场发射扫描电子显微镜（SEM）,原子力显微镜（AFM）和接触角测量仪对试样进行表征。2.将小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞接种于不同微纳米形貌表面,经不同的时间培养后采用SEM、共聚焦显微镜（CLSM）分析RAW264.7细胞形态学变化;流式细胞术、qRT-PCR和Western blot检测CCR7/CD206、iNOS/Arg1等M1/M2极化标记物的表达,比较不同微纳米形貌对小鼠RAW264.7细胞形态及功能的影响。3.将小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞接种于不同微纳米形貌表面,透射电镜（TEM）、CLSM用于检测自噬小体,western blot用于检测自噬蛋白LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、Beclin-1及ERK、p-ERK蛋白的表达水平。用自噬抑制剂3-MA、自噬激活剂RAPA、自噬晚期抑制剂巴弗洛霉素（BAF）和巴弗洛霉素+雷帕霉素（BAF+RAPA）及ERK抑制剂U0126分别处理接种于不同形貌表面的RAW264.7细胞,通过透射电镜、共聚焦显微镜检测自噬小体,western blot检测自噬相关蛋白及M2极化特异性蛋白Arg1的表达。4.采用常规“溶胶-凝胶”法,以四乙基硅酸盐（TEOS）和模板表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）为原料,在碱性水溶液中合成介孔二氧化硅纳米颗粒（MSN）。通过搅拌将地塞米松（DEX）加载到MSN中,透析法测定DEX@MSN中DEX的释放。采用TEM、SEM、AFM观察和动态光散射分析（DLS）对DEX和DEX@MSN颗粒进行了表征。CCK-8试剂盒用于测试DEX@MSN的细胞相容性,qRT-PCR用于检测M2型巨噬细胞的特异性标记物Arg1的表达。之后,在5V下用阳极氧化预处理Ti试样表面形成直径约30nm的二氧化钛纳米管（NT-30）,通过电泳沉积（EPD）将壳聚糖与DEX@MSN共沉积在NT-30表面。CCK-8检测（DEX@MSN）Chi-Ti的细胞相容性,qRT-PCR检测Arg1 mRNA表达水平。通过二者优化沉积参数后,收集接种于（DEX@MSN）Chi-Ti 5 min组及NT-30组试样表面RAW264.7细胞的上清液以刺激小鼠原代骨髓间充质干细胞（BMSC）。通过茜素红染色和碱性磷酸酶（ALP）产生分析评估BMSC的成骨分化。研究结果1.通过酸蚀和阳极氧化成功在纯钛表面构建管径为30nm和100nm纳米管阵列的微纳米复合形貌。AFM获得粗糙度:即P组<NT-30组<NT-100组。接触角测量结果得出P组>NT-30组>NT-100组,则润湿性及亲水性为P组<NT-30组<NT-100组,其中NT-30组及NT-100组为超亲水表面。蛋白吸附水平总体趋势:P组<NT-30组<NT-100组,吸脱附达到平衡需约12小时。2.将小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞培养于不同表面形貌钛材料,发现在3种表面细胞初期粘附P组最多,其次是NT-100组。通过SEM和CLSM可发现形貌会影响巨噬细胞形态,P组表面细胞增殖最快,其次是NT-100组,两组均呈M1表型（“星”型）,而NT-30组表面细胞最少,呈现M2表型（“纺锤”状）。qRT-PCR、WB及FC结果均提示NT-30组诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞更多向M2型极化,而P组和NT-100组材料更多诱导发生M1型极化。3.与对照组P组相比,NT-30组能够引起小鼠RAW264.7细胞的自噬反应。通过MDC和CYTO-ID染色以及透射电子显微镜（TEM）观察证实,NT-30表面上的自噬泡（AVs）数量显著增加,WB显示P组及NT-30组均诱导LC3-II形成,甚至在NT-30表面上进一步增强。此外,通过3-甲基腺嘌呤（3-MA）或雷帕霉素（RAPA）干预自噬,MDC和CYTO-ID染色以及TEM发现分别减少或增加自噬体数量,WB证实LC3-II及Arg1表达分别被减弱或增强。此外,通过巴弗洛霉素（BAF）阻断自噬体和溶酶体之间的融合,无论雷帕霉素存在与否,AVs形成均增强,LC3-II表达也显著增强,但Arg1表达均显著降低。最后,在NT-30表面上检测MAPK信号通路,发现NT-30表面选择性地上调ERK磷酸化及Beclin-1的表达。用U0126抑制ERK活性,P组及NT-30组表面AVs数明显减少,LC3-II、Beclin-1和Arg1表达也显著降低。4.TEM及SEM观察MSN显示出特征性的100nm球形,其内部含约4nm直径的纳米隧道。DEX加载后,纳米隧道不可见,而粒径没有变化。DEX@MSN的平均载药量约为5.32%,平均包封率约为54.5%。DEX@MSN可以体外持续释放DEX。在适当浓度下DEX@MSN显示出有利的细胞相容性。与未处理的细胞组相比,DEX@MSN作用于RAW264.7细胞显示出高出10倍以上的Arg1表达。将DEX@MSN与壳聚糖共沉积在NT-30表面,加载时间不同而获得不同组（DEX@MSN）Chi-Ti试样。各组（DEX@MSN）Chi-Ti在1天和3天均表现为良好的细胞相容性。相较于其他组,（DEX@MSN）Chi-Ti 5min组表面显着增强Arg1表达至5倍以上。此外,在加入NT-30或者EPD组的巨噬细胞条件培养基,与BMSCs共培养后进行碱性磷酸酶及茜素红染色,发现各组均可见深蓝色结晶及深红色的矿化结节,其中EPD组明显多于NT-30组,成骨分化显著增强。结论1.成功构建管径为30nm和100nm纳米管阵列的微纳米复合形貌。2.NT-30组诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞更多向M2型极化,而P组和NT-100组材料更多诱导发生M1型极化。3.NT-30复合形貌促进巨噬细胞M2型极化,形成利于组织修复的微环境。其机制是通过ERK通路介导的自噬反应促进了巨噬细胞M2型极化。提供微纳米形貌结构诱导巨噬细胞M2极化机制的新见解,并提出干预该通路影响成骨微环境的新策略。4.通过MSN为载体构建了载药局部缓释纳米递送系统,联合钛表面微纳米复合形貌协同调节巨噬细胞向抗炎表型（M2方向）极化,从而优化成骨微环境以利于小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化。本研究丰富了缓释药物递送载体的研究,又启发我们利用免疫细胞与骨组织再生的关系,为设计新型生物材料启发了新思路。