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脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)为革兰氏阴性细菌细胞壁外膜的主要成分,具有一定的免疫活性。南极嗜冷细菌对极地海域极端环境的长期适应,已经具备了独特的生理生化特性,近几年国内外研究表明,极地细菌的组分成分及其代谢产物均具有较好的免疫活性。本实验室从南极海洋中分离得到一株典型的嗜冷菌,经过鉴定命名为南极寡营养细菌AT82 (Alteromonas stellipolaris, AT82),简称AT82。前期的研究发现,AT82脂多糖免疫注射黑鲷和大黄鱼后,能显著提高它们的白细胞吞噬活性、血清的抗菌活力和酚氧化酶活力,显示出AT82 LPS对水产动物具有一定的安全性和免疫增强活性。本试验将在此基础上,研究AT82 LPS对三疣梭子蟹非特异性免疫的影响,期望为海洋经济蟹类病害的生物防治和免疫增强剂的筛选提供参考,也为南极寡营养细菌生物活性物质制剂的开发提供依据。1 AT82液体培养条件优化及其脂多糖提取方法的改良以Zobell 2216E为基础培养基,通过对起始pH值,培养温度,摇床转速和接种量的研究,以菌体生长量和脂多糖提取液中多糖含量为评价指标,得到AT82液体培养的最佳条件：起始pH 7.5,培养温度8℃,摇床转速150r/min,接种量5%,装液量200mL／500mL三角瓶,培养时间5d,此条件下得到的菌体干重为0.064g。在AT82脂多糖的提取方面,以传统的酚水法为基础,在AT82菌悬液中增加溶菌酶(含50μg/mL)温育1h,超声波破碎30min, DNA酶和RNA酶(含50μg/mL)温育1h后,脂多糖的得率从2.42%提高到6.73%,即从10g干菌体中可获得0.673g粗脂多糖干粉。2 AT82粗脂多糖及其灭活疫苗对三疣梭子蟹非特异性免疫的影响本试验研究了通过体腔注射AT82粗LPS及其灭活菌体疫苗后,分别在第3、6、9、12d时对三疣梭子蟹抽血。通过分析免疫后不同处理组梭子蟹血清的抗菌活力、溶菌酶、酚氧化酶、过氧化物酶、SOD酶、酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活力以及血细胞吞噬活力的变化,以研究它们对梭子蟹非特异性免疫功能的影响。结果表明,与对照组和生理盐水组相比,灭活疫苗注射组(菌悬液浓度5×108cells/mL),低剂量LPS注射组(2mg/kg蟹体重)和高剂量LPS注射组(4mg/kg蟹体重)在第6、9d时可以显著提高血清中溶菌酶、酚氧化酶、过氧化物酶、酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活力以及抗菌活力,在第9、12d时可以显著提高血清中SOD酶活力,第3、6d时可以显著提高血细胞的吞噬活力(p<0.05)。而且低剂量的LPS对抗菌活力,溶菌酶,酚氧化酶,酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活力以及血细胞吞噬活力的增强效果要优于高剂量的LPS和灭活疫苗,表明低剂量LPS的免疫增强效果可能会更好。3 AT82粗脂多糖的分离纯化采用Cellulose DEAE-52柱层析法对AT82粗脂多糖进了分离,采用SephadexG-100凝胶柱层析法对分离组分进一步的纯化。结果表明,AT82粗脂多糖上Cellulose DEAE-52层析柱,得到2个主要组分LPS1和LPS2,得率分别为29.38%和16.97%。取LPS1和LPS2经Sephadex G-100凝胶柱层析后,分别得到纯组分LPS1a和LPS2a,得率分别为41.62%和26.31%。4纯组分LPSla和LPS2a的结构分析采用气相色谱、凝胶渗透色谱、傅里叶变换红外光谱等手段对LPS各纯化组分的单糖组成、相对分子质量及主要特征基团等进行了研究。结果表明,LPSla由鼠李糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖组成,分别占总糖的相对百分含量为33.69、21.13、0.54和34.85%。LPS2a由鼠李糖、木糖、山梨糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖组成,分别占总糖的相对百分含量为24.88、0.92、4.55、13.98、12.07和24.43%。红外图谱表明,两者均存在呋喃糖环和β-糖苷键。凝胶渗透色谱分析表明,LPS1a为相对均一的多糖,相对分子质量1.44×106,LPS2a为非均一多糖,其主要组分的相对分子质量1.75×106。5 AT82粗LPS及其纯化组分的抗氧化活性和体外对小鼠免疫功能的影响AT82粗脂多糖及其纯化组分均能有效地清除DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基,可有效抑制试验小鼠肝组织和肝线粒体脂质过氧化过程中丙二醛的产生,它们不仅能单独刺激小鼠脾淋巴细胞的转化,而且与ConA具有协同作用,并随着剂量的不同呈现双向性变化。研究还发现,LPS1比LPS2有更好的抗氧化活性和免疫调节作用,这可能与LPS1的分子量较小,含有O-糖苷键、三螺旋结构及较多的甘露糖和葡萄糖有关。