1.研究背景及目的多发性硬化症(multiple sclerosis,MS)是一种以髓鞘脱失和神经元变性为特点的中枢神经系统(central nervous system,CNS)自身免疫炎症性疾病。实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis,EAE)是一种以CNS内小血管周边大量单个核细胞弥漫浸润及脱髓鞘为特点的MS动物实验模型。MS的致病因素多样,疾病进展的驱动机制复杂。近年来对中枢神经系统免疫微环境的研究结果表明,小胶质细胞在MS的疾病诱发和进展中起重要作用[1]。因此,聚焦中枢神经系统小胶质细胞的调控,改变中枢神经系统免疫微环境的属性和状态,对于包括MS在内的多种中枢神经系统疾病的治疗具有核心且共通性的研究价值。目前,MS的临床治疗处于“能缓不能治,治标不治本”的状态,在MS“高发与难治”的强烈对比下,MS的疾病机理认识与治疗手段拓展成为现代免疫学、神经生物学与新药研发的共同关注热点与应用焦点,具有明确的科学创新意义与实践应用价值。倍半萜类化合物双氢青蒿素(Dihydroartemisinin,DHA)分子式为:C15H24O5分子量为284.35,物化性质为白色结晶或结晶性粉末[2]。随着对DHA研究的不断深入,DHA的药效药理学优势不仅仅只局限在治疗疟疾,其在抗炎免疫调节方面也显示出极大的应用前景。前期研究发现其在治疗免疫性疾病,特别是针对自身免疫病具有明确的有效性,并且初步明确了DHA能够通过调控Th17/Treg细胞平衡机制进而抑制自身免疫炎症性肠病(IBD)[3]。但目前上述研究仍存在关键科学问题的研究空白:(1)DHA调控免疫炎症的共通基础不明,疾病谱不清,特别是其在中枢神经系统自身免疫炎症调控中的应用有效性缺乏系统研究;(2)DHA调控T细胞平衡的免疫过程不明,其对免疫炎性微环境的调控活性缺乏系统的阐释和实验描述;(3)DHA发挥免疫调控活性的潜在分子机制不明,具体分子靶点和相关信号通路缺乏精细化的分析和揭示;基于上述分析,从药效评价、免疫功能揭示、分子机制探索三个方面开展DHA的全面系统研究,是提升DHA药物认识水平,促进DHA合理有效应用的关键研究内容。众所周知,T细胞的平衡调控是一个复杂而庞大的体系,而“抗原递呈细胞-T细胞”的整合作用单元在T细胞的免疫功能平衡调控中发挥着重要的作用,是自身免疫炎症损伤启动和持续激活的核心病理基础。而基于上述理论的DHA药物研究仍为空白。因此,本文结合DHA的药效特点和MS的病理特征,建立系统的EAE药效评价体系,开展全面的DHA药效活性评价。以中枢神经系统中的抗原递呈细胞小胶质细胞的浸润和激活为基础,建立基于小胶质细胞-T细胞相互作用的免疫活性研究策略,拓展DHA的炎症调节活性认识。并以中枢神经系统炎症中小胶质细胞的功能性改变为切入点,进行机制挖掘和研究,完善“点面集合”的分子药理机制揭示研究,明确分子机理和活性特征,探索DHA在EAE病理环境的重塑中发挥的作用。2.研究方法和内容1.DHA治疗EAE模型小鼠的药效学作用研究(1)建立MOG35-55实验性自身免疫脑脊髓炎动物模型。包括复发缓解(RRMS)动物模型和继发进展(SPMS)动物模型,以DHA2mg/kg/d,10mg/kg/d,20mg/kg/d为给药低,中,高剂量,甲泼尼龙1mg/kg/d为阳性药。分别在小鼠造模第2天开始灌胃给药干预。正常对照组和模型组分别给予等剂量的溶剂。每日定时观测小鼠的状态变化。RRMS动物模型:连续给药23天后,小鼠步态仪进行步态行为检测小鼠机能动态变化。行为学检测后,一部分取出脑和脊髓组织进行组织学(LFB,透射电镜)检测;另一部分小鼠分离血清和脑脊液。SPMS动物模型:连续给药53天后,开始进行步态行为学检测小鼠机能动态变化。行为学实验结束后,采用脊髓和脑组织进行Olig 2的免疫组织化学检测。(2)RRMS小鼠行为学检测后,取出脊髓和脑进行H&E染色,检测炎症细胞浸润的情况;分离中枢神经系统单个核细胞(MNCS),qRT-PCR法检测MNCS中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6和抑炎因子IL-10、TGF-β的mRNA表达2.DHA对EAE模型小鼠的抗炎免疫活性认识的研究(1)分离小鼠中枢神经系统内的单个细胞,进行细胞质检,将细胞数目调整至浓度为1 × 106/mL;10X标记cDNA片段,建库,测序,得到测序数据。采用PCA降维度的方式来看细胞之间的相似性,针对PCA结果中解释方差最大的前10个主成分,采用T-Distributed Stochastic Neighbor Embedding对单细胞群聚类进行可视化,进而得到与EAE疾病相关的细胞亚群和差异基因。(2)体外培养小鼠巨噬细胞株Raw 264.7和小鼠小胶质细胞株BV2,并且体外分离小鼠腹腔巨噬细胞(peritonealmacrophage,PM)。分别以DHA1,4μM为给药低,高剂量和LPS 50ng/ml为造模浓度,细胞经过药物处理24h。首先,RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)的方法在转录水平上检测Raw264.7和PM细胞中负性免疫共刺激分子PDL1的表达;间接免疫荧光技术检测Raw264.7,BV2和PM三种细胞表面免疫共刺激分子PDL1的蛋白表达水平;采用人外周血白血病T细胞JurkatT与小鼠小胶质细胞BV2建立体外“巨噬细胞-T细胞”共培养模型,通过流式细胞技术检测在共培养体系中,DHA对Jurkat T细胞中Treg细胞的分化水平(FOXP3的表达)。(3)体外分离小鼠中枢神经系统单个核细胞(MNCS),qRT-PCR的方法检测CCL5的表达;ELISA法检测EAE模型小鼠血清和脑脊液中CCL5的含量;趋化实验中,ELISA法检测BV2培养上清中CCL5的含量;transwell法验检测CCL5对小胶质细胞趋化能力变化。(4)体外分离小鼠中枢神经系统单个核细胞(MNCS),qRT-PCR的方法检测AXL的表达;Western Blot法检测BV2细胞AXL的蛋白表达情况;吞噬试验中,先诱导PC12细胞凋亡,Annexin V-FITC双染法检测PC12细胞的凋亡率;间接免疫荧光方法检测BV2细胞对凋亡的PC12细胞的吞噬能力,并且采用荧光显微镜观察BV2细胞对凋亡PC12细胞的吞噬情况。3.聚焦“小胶质细胞功能调节”的DHA抑制中枢神经系统炎症的分子机制研究(1)为了在分子机制水平上验证DHA对AXL的依赖性,我们使用AXL的阻断剂SGI7079(0.2μM)阻断AXL的激活,我们首先采用BV2细胞吞噬凋亡PC12细胞的方法检测BV2细胞吞噬能力的变化;transwell法验检测CCL5对小鼠小胶质细胞BV2趋化能力变化;最后采用JurkatT与小鼠小胶质细胞BV2建立体外“巨噬细胞-T细胞”共培养模型,间接免疫荧光法检测DHA对Jurkat T细胞中Treg细胞的分化水平(FOXP3的表达)。(2)Western Blot法检测BV2细胞经过DHA和LPS处理后AXL,Phospho-AXL,SOCS3,Phospho-STAT1的表达。在上述研究的基础上加入SGI7079作用后,同样检测AXL,Phospho-AXL,SOCS3,Phospho-STAT1 的表达情况。(3)BV2细胞用DHA1和4 μM作用24h后,间接免疫荧光方法检测BV2细胞的PDL1,FOXP3,CYSE/F480的表达量,ELISA法检测BV2细胞上清中CCL5的含量,transwell法检测对BV2细胞的趋化能力。BV2细胞用IFN-β和STAT1阻断剂Fludarabine作用后,间接免疫荧光法检测CYSE+/F480+的表达量,Western Blot检测Phospho-STAT1,SOCS3,Total-AXL,Phospho-AXL的蛋白表达量。3.研究结果1.DHA治疗EAE模型小鼠的药效学作用研究模型验证:MOG35-55造模后,每日疾病评分逐渐增加;行为学步态等指标出现明确障碍。组织学水平和脊髓电镜超显微结构结果显示上伴随有髓鞘脱失。上述结果证明:EAE模型造模成功,满足用于药物评价的实验要求。1.1 DHA在EAE小鼠中具有机能改善和神经保护的作用RRMS动物模型药效验证:RRMS主要是发病的初期阶段,以中枢神经系统炎症为主并伴随有髓鞘脱失,因此,进行炎症损伤和神经保护检测。与EAE模型组相比,DHA各给药组和MET组能够改善EAE模型小鼠的技能活动障碍。并且在组织学水平上能够对髓鞘起到保护作用。在神经保护作用层面上,DHA中剂量效果明显优于MET组。SPMS动物模型药效验证:SPMS是发病的后期,主要是少突胶质细胞失活而导致髓鞘大量的脱失,Olig 2则是少突胶质细胞的活性标记物,因此通过检测Olig 2的表达来反映少突胶质细胞的活性。与EAE模型组小鼠相比,DHA各给药组和MET组均能够改善EAE模型小鼠的机能活动障碍。组织学水平上,DHA各个剂量组和MET组均能显著提高Olig 2的阳性表达率,并且DHA剂量组具有剂量依赖性。1.2 DHA能够抑制RRMS小鼠中枢神经系统炎症H&E结果显示DHA和MET均能显著降低脑组织和脊髓组织中的炎症细胞浸润水平;DHA各个给药组和MET组均能够下调促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA表达,相反,抑炎因子IL-10、TGF-β的转录明显激活;同时,DHA重塑炎症反应平衡的活性具有显著的剂量依赖性,并且DHA中,高剂量组均优于MET组。2.DHA对EAE模型小鼠的抗炎免疫活性认识的研究2.1基于10X Genomics技术对DHA调控EAE小鼠中枢神经系统单个核细胞亚群分析细胞亚群分析:得到了 14个细胞亚群,而与EAE疾病模型进程相关性最大的两类细胞亚群分别是巨噬细胞和小胶质细胞。差异基因分析:在EAE模型小鼠的14个细胞亚群中筛选出受DHA调控的基差异基因共305个,而在巨噬细胞和小胶质细胞中富集了差异明显(Fold change>2)的基因共计25个。最后,通过文献挖掘与分子验证,选择富集度最高的并且与EAE疾病进程关系较为密切的候选基因基因:AXL和CCL5,进行进一步的药理学分子机制研究;同时,基于前期研究提示和最新的免疫学研究进展,聚焦“小胶质细胞-T细胞整合调控单元”,从抗原递呈的双信号系统入手,从另一个角度开展药理学研究。2.2 DHA对自身免疫抗原递呈的药物活性研究首先,在分子水平,以Raw264.7和腹腔巨噬细胞为模型,DHA能够显著上调PDL1在细胞表面的表达水平;同时,在功能水平,DHA还能够促进Jurkat T细胞分化成Treg细胞,上调Treg表面标记分子FOXP3的表达。2.3 DHA对自身免疫炎性趋化的药物活性研究体内实验中,qRT-PCR结果表明,在MNCS中,DHA和MET均能够在转录水平抑制CCL5的表达,并且具有剂量依赖性,DHA效果优于MET组。ELISA结果说明,DHA能够减少EAE模型小鼠血清和脑脊液中CCL5的含量。体外实验中,ELISA结果显示,LPS能够升高BV2细胞培养上清中CCL5的含量,而DHA能够减少CCL5的含量;transwell的检测结果中,DHA能够减弱对BV2细胞的趋化能力。2.4 DHA对自身免疫炎症原清除的活性研究体内实验中,qRT-PCR结果表明,在MNCS中,DHA和MET均能够上调吞噬核心介导分子AXL的表达。Western Blot检测表明,DHA可以显著上调BV2细胞中AXL的表达;同时,通过凋亡细胞清除实验,荧光显微镜观察与流式细胞分析分别从定性与定量的双重角度证明:在PC12细胞诱导凋亡成功有效的前提下,DHA能够促进小胶质细胞对凋亡细胞的胞葬能力,促进凋亡细胞碎片的有效清除。3.聚焦“小胶质细胞功能调节”的DHA抑制中枢神经系统炎症的分子机制研究3.1基于小胶质细胞的功能体系的DHA靶向AXL的作用机制研究在进一步的机制研究中发现,BV2细胞在AXL的阻断剂SGI7079干预后,间接免疫荧光结果显示,DHA对自身免疫抗原递呈的能力可被SGI7079所消除;荧光显微镜观察和间接免疫荧光检测可发现,DHA对自身免疫炎症原清除能力也被SGI7079所抑制;transwell检测表明,自身免疫炎性趋化能力也被SGI7079所阻断。3.2 DHA基于AXL调控自身免疫炎症的分子通路研究机制通路水平的研究中,Western Blot检测表明,DHA分别能够上调Total-AXL,SOCS3,Phospho-STAT1蛋白的表达,差异具有统计学意义。而加入SGI7079作用后,DHA在上调Total-AXL的表达的情况下,其他Phospho-AXL,SOCS3,Phospho-STAT1蛋白的表达均被抑制。3.3 DHA对炎症“促-抑”平衡调控的病理状态特异性研究的初探间接免疫荧光结果表明,与NC组相比,DHA单独干预对自身免疫抗原递呈,自身免疫炎性趋化,自身免疫炎症原清除能力均无显著性差异;BV2细胞在IFN-β干预后,间接免疫荧光结果显示DHA可以增加CYSE+/F480+的细胞亚群的数量,促进BV2的吞噬能力,Fludarabine干预后BV2的吞噬能力则消失了。Western Blot检测表明,在IFN-β干预下,DHA就能上调Phospho-AXL,SOCS3,Phospho-STAT1蛋白的表达,当Fludarabine加入后,DHA对以上蛋白表达均无显著性差异。4.结论1.DHA可以改善EAE小鼠的运动机能障碍;并且在组织学水平上具有神经保护和调节炎症的作用,进一步缓解EAE模型小鼠的中枢神经系统炎症;2.中枢神经系统巨噬细胞及小胶质细胞是DHA在EAE模型中的主要效应细胞,同时小胶质细胞中AXL、CCL5等相关炎症分子的变化构成了DHA发挥药效的主要分子基础;3.DHA在中枢神经系统中对自身免疫性炎症的抗原递呈、炎症趋化、抗原清除发挥了系统而多样的调节活性,最终实现了自身免疫炎症反应的平衡重塑和髓鞘保护。分别总结如下:(1)DHA可以调节抗原加工递呈过程,降低T细胞对自身抗原的高反应状态。促进免疫共抑制分子PDL1的表面表达,逆转中枢神经系统自身免疫性炎症的过激状态,重塑T细胞(Th17/Treg)炎症促抑平衡。(2)DHA可以减少炎性趋化,降低CNS中炎性细胞的募集浸润水平。DHA能显著抑制炎性趋化因子CCL5的表达和分泌,减少炎症损伤部位炎性细胞的浸润,降低炎性细胞的运动趋化能力,进而延缓炎症损伤进展。(3)DHA能够增加小胶质细胞对损伤髓鞘的有效清除,促进炎症进程的主动消散。DHA能够显著且特异性的上调吞噬受体AXL的表达,加强病灶内凋亡细胞碎片的清除能力,减少自身免疫炎症原的暴露,削弱炎症反应的诱发水平。4 DHA对自身免疫炎症反应的调节活性聚焦于对AXL这一分子靶点的有效调控并依赖于“IFNAR-STAT1-SOCS3”信号通路的高水平活化状态。上述分子机制研究也为DHA治疗自身免疫炎症提供了病理选择性和药效特异性的初步实验提示。