红细胞生成经历了骨髓多能干细胞向红系的分化决定以及红系祖细胞的继续分化和发育成熟。这一过程涉及多个基因有序开启和关闭的复杂而又精密的调控。小RNA(microRNA,miRNA)是一类长度约为21-23个核苷酸的重要调节分子,它可以通过靶mRNA剪切或翻译抑制的方式在转录后水平抑制蛋白编码基因的表达。迄今共发现了500多种人类miRNAs,估计约有30%的人类基因被miRNAs调节。K562细胞系是红白血病细胞系,处于多能髓样祖细胞阶段而停止继续分化。在氯高铁血红素(hemin)诱导下可继续红系分化过程,在佛波酯(PMA)的诱导下可以向巨核系分化。我们应用小RNA芯片分析了hemin诱导K562细胞红系分化前后miRNA表达的变化,发现31个在K562细胞中表达明显的miRNAs,其中8个,miR-92、miR-17-3p、miR-19a、miR-19b、miR-126、miR-18a、miR-17-5p和miR-20b呈现高表达。比较hemin诱导K562细胞红系分化前后miRNA的表达,发现15个表达变化的miRNAs。其中上调的有7个miRNAs,miR-185、miR-422a、miR-130b、miR-451、miR-20b、miR-126和miR-20a;8个下调的miRNAs,miR-25、miR-210、miR-223、miR-27a、miR-103、miR-18b、miR-10a和miR-130a。用Northern blot验证芯片结果,显示miR-103、miR-130a、miR-18b和miR-210在红系分化过程中降低;miR-126和miR-451在这一过程中升高,与芯片结果一致;miR-146b在hemin、PMA诱导的K562细胞红系和巨核系分化过程中都明显升高。提示它们可能在红系分化过程中发挥重要作用。用Northern blot方法检测了miR-103、miR-130a、miR-18b、miR-210、miR-126、miR-451和miR-146b在10种白血病或淋巴瘤来源的细胞系的表达,发现除miR-103外,其余的miRNAs在红白血病细胞系(K562或HEL)表现出一定程度的富集。进一步用实时定量PCR(Real-time PCR)方法检测了这些miRNAs在脐血来源的CD34+干/祖细胞体外红系诱导培养过程中的表达变化,发现与K562红系分化过程中的变化趋势一致,即miR-126、miR-451和miR-146b在红系分化过程中明显升高;miR-103、miR-130a、miR-210和miR-18b在这一过程中明显降低。进一步提示这些miRNAs可能在红系分化中发挥重要调控作用。我们进一步研究了miR-103和miR-146b在红系分化过程中的功能。用寡核苷酸miR-103前体瞬时转染K562细胞,观察增加miR-103表达对红系分化的影响。结果显示过表达miR-103的K562细胞与对照细胞相比,在hemin诱导后不同时间点联苯胺染色阳性细胞比率都明显降低。说明过表达miR-103能够在一定程度上抑制hemin诱导的K562细胞红系分化。为了研究miR-146b在红系、巨核系分化中可能的作用,我们构建了过表达miR-146b的重组质粒pcDNA-146b。瞬时转染K562细胞后,观察到过表达miR-146b的K562细胞表现出较高水平的红系和巨核系分化能力。在过表达miR-146b的pcDNA-146b/K562稳定株中得出与瞬时转染相同的结果,无论在诱导前还是诱导后不同时间点联苯胺染色阳性细胞数量都明显高于K562细胞。进一步试验了miR-103和miR-126在红系分化中的作用机制。首先通过软件预测筛选到10个miR-103可能的靶基因。将这些候选靶基因3′UTR区可能与miRNA作用的位点分别克隆到萤光报告基因下游,与miR-103前体共同转染Hela细胞后,观察过表达miR-103对萤光素酶表达的影响。结果发现过表达miR-103能够使克隆有叉头蛋白家族转录因子J2(forkhead box J2,FOXJ2)3′UTR区的报告质粒萤光素酶的表达量降低50%。用Real-time PCR和Westen blot的方法检测过表达miR-103的Hela细胞和K562细胞中FOXJ2 mRNA和蛋白的表达变化,发现过表达miR-103后,在不改变FOXJ2 mRNA的情况下能够明显降低FOXJ2蛋白表达,证实了FOXJ2是miR-103的靶基因。利用相似的方法鉴别了miR-126的靶基因。首先用预测软件筛选到5个与红系分化有关的可能的靶基因,进一步用萤光报告基因方法观察到携带CRK(v-crk sarcomavirus CT10 oncogene homolog)和蛋白酪氨酸磷酸酶非受体亚单位9(protein tyrosinephosphatase,non-receptor type 9,PTPN9)3′UTR区的报告质粒萤光素酶的表达量在过表达miR-126时明显降低。最后用Westen blot方法证实了PTPN9蛋白的表达也在miR-126升高后明显降低。FOXJ2是具有叉头结构转录因子的一种,已有试验证实这类因子参与了多种细胞的增殖与分化过程。推测miR-103对红系分化的作用可能是通过抑制FOXJ2表达实现的。PTPN9是蛋白酪氨酸家族成员,已有报道这一家族在细胞生长、分化、有丝分裂和癌基因的转化等过程中具有重要作用。PTPN9的表达对于维持红细胞的增殖能力和活力方面具有重要的作用,但是过高水平的PTPN9能够使得大量的未成熟的红细胞聚集,进一步导致红细胞增多症(polythemia vera PV)。我们发现hemin诱导24小时后PTPN9 mRNA已明显升高,而它的蛋白表达几乎没有太大的变化。在红系分化过程中表达增加的miR-126可能作用于PTPN9 mRNA,防止PTPN9蛋白无限制地高水平表达。miRNA在红系分化过程中的功能探讨为红系分化机制的研究增添了新的调控层次。我们分析了K562细胞hemin诱导前后miRNAs的表达变化,得到了一系列在K562细胞中高表达和红系诱导后变化的miRNAs;研究了miR-103在红系分化和miR-146b在红系、巨核系分化中功能作用;确定了miR-103和miR-126的靶基因。这些结果为红系分化详细机制和调控网络的揭示提供了有意义的资料和重要线索,并可能对造血细胞分化相关疾病的研究和治疗提供潜在的线索。