一、目的和意义近年来,女性不孕症的发病率显著增加(8-17%),不孕症的病因有输卵管异常、排卵障碍、免疫性不孕和不明原因的不孕等。对不孕症的早期诊断及治疗方法的研究具有重要意义。成功的胚胎植入需要胚胎和子宫内膜二者功能同步。发育成熟的胚胎定置、黏附并侵入子宫内膜,完成胚胎植入。胚胎由内细胞团和外部的滋养层细胞组成。其中,滋养层细胞对胚胎起到“driver”的作用。胚胎滋养层细胞由细胞滋养层细胞转化为间充质样的绒毛外滋养层细胞(Extravillous trophoblast,EVT)的过程在胚胎植入中发挥重要作用。绒毛外滋养层细胞功能异常会引起多种妊娠相关疾病,例如,流产、先兆子痫和胎儿生长受限等。许多分子影响胚胎滋养层细胞发生上皮-间充质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)的过程,如细胞因子、生长因子、类固醇激素、蛋白酶等。表皮调节素(epiregulin)是表皮生长因子家族成员,在生殖过程中起重要作用。例如:卵巢颗粒细胞中的表皮调节素促进卵母细胞发育,表皮调节素缺失的小鼠表现出卵母细胞成熟延迟。在胎盘和子宫腔内的囊胚植入位点也能检测到表皮调节素的表达。目前表皮调节素与胚胎滋养层细胞EMT过程以及流产的关系未见报道。蛋白质的糖基化在多种生理和病理过程中发挥作用,并且是蛋白质翻译修饰的主要方式。蛋白质岩藻糖基化修饰主要分为两种形式:N-岩藻糖基化修饰和O-岩藻糖基化修饰。蛋白质O-岩藻糖基转移酶1和2(protein O-fucosyltransferase1/2,po FUT1/po FUT2)是催化O-岩藻糖基化合成的关键酶。po FUT1定位在细胞内质网中。含有共有序列C2XXXX(S/T)C3的表皮生长因子样(Epidermal Growth Factor,EGF)重复序列是po FUT1作用的受体底物,po FUT1在多肽链的丝氨酸或苏氨酸的残基上连接供体L-Fucose,形成O-连接岩藻糖。研究发现敲除po FUT1基因的小鼠会出现鼠胚畸形的现象,甚至导致胚胎死亡。实验室前期研究发现,蛋白质O-岩藻糖基化修饰在生殖过程中发挥重要作用。例如,异常的蛋白质O-岩藻糖基化修饰会抑制胚胎的增殖与黏附能力;po FUT1可以促进子宫基质细胞蜕膜化过程。因此本研究中,进一步探讨po FUT1以及O-岩藻糖基化修饰在胚胎滋养层细胞EMT过程中的作用及分子机制。尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator,u PA)是一种O-岩藻糖基化糖蛋白,在Thr18上含有O-岩藻糖基化修饰位点,并且此糖基化修饰位点位于u PA与u PAR的结合区域。当u PA与u PAR结合后可激活纤溶酶原,细胞外基质降解,促进细胞迁移和侵袭能力。u PA/u PAR在肿瘤中研究报导较多,与肿瘤细胞迁移侵袭能力密切相关,而在生殖中的作用研究较少。实验探讨po FUT1对u PA分子O-岩藻糖基化修饰的调节作用,O-岩藻糖基化修饰对u PA与u PAR的结合能力的影响,以及在滋养层细胞发生EMT过程中的作用。本研究利用正常早孕妇女与流产患者的血清、人绒毛组织,绒毛滋养层细胞系(JAR/HTR8-S/Vneo)和小鼠模型,比较正常早孕妇女与流产患者血清中表皮调节素和po FUT1含量,并分析表皮调节素和po FUT1在滋养层细胞发生EMT过程中的作用及机制,为临床血清学检测流产提供实验分析指标,为不孕症的治疗提供实验基础。二、实验方法(一)正常妊娠及流产患者血清和绒毛组织中表皮调节素和po FUT1的表达分析1、ELISA和Western blot分析未孕、早孕以及流产患者血清中的表皮调节素、po FUT1和u PA的表达水平,表皮调节素和po FUT1分别在早孕和流产患者血清中的相关性分析和ROC曲线分析;2、Western blot和组织免疫荧光检测表皮调节素和po FUT1在早孕和流产患者绒毛组织中的差异表达,以及EMT标志物(E-钙黏蛋白/N-钙黏蛋白)的差异表达。(二)表皮调节素对po FUT1和u PA分子O-岩藻糖基化合成的调节及促进滋养层细胞的EMT作用1、Real-time PCR和Western blot检测不同浓度与不同作用时间下表皮调节素对滋养层细胞中EMT标志物的影响,明胶酶谱检测表皮调节素处理后,滋养层细胞对基质的降解能力,Transwell检测细胞的迁移侵袭能力;2、Western blot和免疫荧光检测表皮调节素通过转录因子c-Jun/c-Fos影响po FUT1的表达,Western blot检测分别转染po FUT1 si RNA与po FUT1 c DNA对po FUT1表达的影响;3、免疫沉淀实验检测分别转染po FUT1 si RNA与po FUT1 c DNA影响u PA分子O-Fucose合成变化和u PA与u PAR的结合能力,以及共转染了u PA突变质粒(u PA MUT)和po FUT1 c DNA之后u PA分子O-Fucose合成变化和u PA与u PAR的结合能力;4、Western blot检测分别转染po FUT1 si RNA与po FUT1 c DNA对下游PI3K/Akt信号通路的影响,以及共转染u PA突变质粒和po FUT1 c DNA之后对下游PI3K/Akt信号通路的影响;5、表皮调节素处理、转染po FUT1 si RNA、转染po FUT1 si RNA之后表皮调节素处理、TIIA(AP-1抑制剂)和LY294002(PI3K抑制剂)处理,以上实验组通过Western blot检测不同处理后对下游PI3K/Akt信号通路的影响,明胶酶谱实验和Ttranswell实验检测细胞基质外降解的能力,以及细胞的侵袭能力。(三)表皮调节素促进小鼠胚胎着床功能的研究1、免疫荧光方法检测鼠胚体外用含有表皮调节素的培养基处理后,对鼠胚中po FUT1表达的影响,免疫荧光方法检测鼠胚体外转染po FUT1 si RN A与po FUT1 c DNA后,鼠胚中po FUT1的表达变化;2、免疫荧光方法检测鼠胚体外用含有表皮调节素的培养基处理后,鼠胚中EMT标志物的表达变化,以及HLA-G的表达变化;3、利用假孕鼠模型,观察体外表皮调节素抗体封闭和转染po FUT1 si RNA的鼠胚转移至雌鼠子宫后,小鼠的着床情况。三、结果(一)正常妊娠及流产患者血清和绒毛组织中表皮调节素和po FUT1的表达分析1、早孕妇女血清中表皮调节素、po FUT1和u PA的表达水平高于未孕妇女,而流产患者血清中三者的表达水平低于早孕妇女;2、早孕妇女绒毛组织中表皮调节素和po FUT1的表达高于流产患者的绒毛组织,早孕妇女绒毛组织中N-钙黏蛋白的表达高于流产患者,而E-钙黏蛋白的表达低于流产患者。(二)表皮调节素对po FUT1和u PA分子O-岩藻糖基化合成的调节及促进滋养层细胞的EMT作用1、表皮调节素促进滋养层细胞EMT和细胞外基质降解能力,同时促进滋养层细胞的侵袭能力;2、表皮调节素激活转录因子c-Jun/c-Fos促进po FUT1的表达,并促进O-Fucose的合成;3、转染po FUT1 si RNA抑制po FUT1表达及O-Fucose的合成;转染po FUT1 c DNA促进po FUT1的表达及O-Fucose的合成,转染po FUT1 si RNA抑制u PA分子O-Fucose的合成,导致u PA与u PAR的结合能力降低,转染po FUT1 c DNA之后u PA分子O-Fucose的合成增加,u PA与u PAR的结合能力增加;4、转染po FUT1 si RNA抑制PI3K/Akt信号通路的激活以及细胞外基质降解,转染po FUT1 c DNA激活PI3K/Akt信号通路,促进细胞外基质降解;5、表皮调节素激活PI3K/Akt信号通路,促进细胞发生EMT行为;而转染po FUT1si RNA会抑制下游PI3K/Akt信号通路,抑制细胞发生EMT行为;用TIIA(AP-1抑制剂)和LY294002(PI3K抑制剂)处理后抑制PI3K/Akt信号通路,同时细胞发生EMT的现象减弱。(三)表皮调节素促进小鼠胚胎着床功能的研究1、小鼠胚胎体外用含有表皮调节素处理后,鼠胚中po FUT1的表达增加,鼠胚体外转染po FUT1 si RNA后,鼠胚中po FUT1表达降低,而转染po FUT1 c DNA之后鼠胚中po FUT1表达增加;2、小鼠胚胎体外用含有表皮调节素处理后,鼠胚中N-钙黏蛋白的表达增加,E-钙黏蛋白的表达降低,鼠胚扩展的滋养层细胞中HLA-G表达增多,促进了细胞的迁移侵袭能力;3、表皮调节素抗体封闭和转染po FUT1 si RNA会明显的抑制小鼠胚胎的着床率。四、结论(一)正常妊娠及流产患者血清和绒毛组织中表皮调节素和po FUT1的表达分析1、表皮调节素和po FUT1在流产患者血清和组织中低表达;2、表皮调节素和po FUT1可作为潜在的诊断标志物。(二)表皮调节素对po FUT1和u PA分子O-岩藻糖基化合成的调节及促进滋养层细胞的EMT作用1、表皮调节素促进滋养层细胞发生EMT;2、po FUT1促进u PA分子O-岩藻糖基化的合成,促进u PA和u PAR的结合,并激活下游PI3K/Akt信号通路;3、表皮调节素通过上调po FUT1表达并增加u PA分子O-岩藻糖基化,进一步激活PI3K/Akt信号通路,促进滋养层细胞的EMT过程。(三)表皮调节素促进小鼠胚胎着床功能的研究1、表皮调节素促进鼠胚中po FUT1的表达;2、表皮调节素促进鼠胚滋养层细胞发生EMT;3、表皮调节素抗体封闭和敲低po FUT1抑制小鼠的胚胎植入。