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第一部分EphB2在B细胞上表达及其作用的初步研究背景：EphB2是受体型酪氨酸激酶Eph家族成员,主要表达于肿瘤细胞和内皮细胞上,可促进肿瘤细胞增殖和迁移及内皮细胞簇集。近年研究发现,EphB2在T细胞和单核细胞上也有表达,并且其前向信号可促进T细胞迁移和单核细胞活化。然而,EphB2在B细胞上的表达及作用至今尚无明确报道。方法：取健康志愿者静脉血,分选出B淋巴细胞。分别利用LPS、anti-IgM和IL-4刺激幼稚B细胞活化,以western blot检测EphB2及其配体ephrinB1/B2蛋白表达情况。同时,通过转染EphB2 siRNA以抑制EphB2表达,并设立阴性对照siRNA(NC)转染组和非转染对照组,检测其对B细胞增殖、分泌细胞因子TNF-α及分泌IgG/IgM抗体水平的影响。结果：EphB2及其特异性配体ephrinB1和ephrinB2在人外周血幼稚B细胞上均有表达,且体外刺激B细胞活化后,EphB2表达显著上调(P<0.05),而ephrinB1和ephrinB2表达均无明显变化。同时,转染siRNA并检测B细胞活化指标,结果显示,与NC转染组和非转染对照组相比,EphB2 siRNA转染组B细胞增殖(P<0.05)、B细胞培养上清TNF-α (P<0.01)及IgG水平(P<0.05)均显著下降,然而各组之间IgM水平无明显差异。结论：EphB2及其配体ephrinB1/B2在人B细胞上有表达,且EphB2在B细胞活化中起到重要的促进作用。第二部分调控B细胞EphB2表达的microRNA的筛选和鉴定背景：microRNA是一种内源性的、长度约为20-24个核苷酸的小RNA,通过与mRNA特异性结合使其降解或抑制其翻译为蛋白质,并因其稳定性、保守性及靶向结合的特异性,成为疾病分子靶向治疗方面的研究热点。有研究显示,在神经胶质瘤细胞和血管内皮细胞中,EphB2表达可受到多种microRNA的调控。因此,筛选出具有特异性调控B细胞EphB2表达的microRNA对进一步研究EphB2在B细胞中的作用机制有重要价值。方法：利用miRWalk数据库并综合参考5种生物信息学分析结果,预测可调控人EphB2表达的microRNAs,并利用实时定量PCR检测上述microRNAs在B细胞中的表达情况。之后,构建含有EphB2 3’UTR结合位点的荧光霉素报告基因载体质粒,并与miR-185模拟物或模拟物NC共转染入工具细胞293T内,检测各组细胞的荧光值,以验证miR-185是否可与EphB2 mRNA特异性结合并影响EphB2表达。另外,通过转染miR-185模拟物和抑制剂进入B细胞,并western检测B细胞EphB2蛋白水平、流式检测EphB2 (+) B细胞百分比和平均荧光强度,以进一步验证miR-185是否可影响B细胞上EphB2的表达;同时,检测B细胞增殖、分泌细胞因子TNF-α及分泌IgG/IgM抗体水平,以探究miR-185对B细胞活化的影响。结果：miRWalk数据库预测出miRNA-185、miRNA-661、miRNA-593、 miRNA-211、miRNA-515和miRNA-204这6种microRNA可调控人EphB2表达。上述6种microRNA在人外周血幼稚B细胞中均有表达,然而只有miRNA-185, miRNA-515和miRNA-204在活化的B细胞中表达下调(P<0.05),且与miRNA-515和miRNA-204相比,miRNA-185下调更为明显(P<0.05)。荧光霉素报告基因结果显示,含EphB2 3’UTR野生型结合位点的报告基因与miRNA-185模拟物共转染组细胞荧光测值下降41%(P<0.01)。进一步,我们分别转染miR-185模拟物和抑制剂进入B细胞,检测到与NC组和非转染对照组相比,miR-185模拟物转染组中western检测B细胞EphB2蛋白水平、流式检测EphB2 (+) B细胞百分比和平均荧光强度均明显下调(P<0.05), miR-185抑制剂转染组中western检测B细胞EphB2蛋白水平、流式检测EphB2 (+) B细胞百分比和平均荧光强度均明显上调(P<0.05)：同时,我们检测各组B细胞活化指标,结果显示,miR-185模拟物转染组B细胞增殖(P<0.05)、B细胞培养上清TNF-α (P<0.01)及IgG水平(P<0.05)均显著下降,miR-185抑制剂转染组B细胞增殖(P<0.05)、B细胞培养上清TNF-α (P<0.01)及IgG水平(P<0.05)均显著上升。结论：miR-185可特异性抑制B细胞上EphB2表达,从而阻碍B细胞活化。第三部分EphB2调控B细胞活化的分子机制背景：细胞活化的核心转录因子为NF-κB,其亚基p65是B细胞活化中的重要信号分子。在神经细胞中,Src为EphB2下游的重要信号分子,可促进神经突触形成和重塑,且最近研究表明Src活化后可激活NF-κB (p65)分子。我们推测EphB2可能通过Src-p65信号通路调控B细胞活化。另外,一种新近发现的信号分子Notch1可参与T细胞活化,但其在B细胞活化中的作用尚不明确。此部分我们将探究上述信号分子在EphB2调控B细胞活化中的作用。方法：通过转染EphB2 siRNA或miR-185模拟物寡聚核苷酸以抑制B细胞EphB2表达,western blot分别检测B细胞phospho-Src/总Src、phospho-p65/总p65及Notch1蛋白水平,以探究EphB2调控B细胞活化中可能激活的信号通路。结果：与对照组相比,EphB2 siRNA和miR-185模拟物转染组B细胞磷酸化Src表达显著下调(P<0.05),各组B细胞总Src表达无明显差异；磷酸化p65表达显著下调(P<0.05),各组B细胞总p65表达无明显差异。同时,EphB2 siRNA和miR-185模拟物转染组B细胞中Notch1的表达受到显著抑制(P<0.05)。结论：EphB2可能通过Src-p65信号通路调控B细胞活化,Notch1也在其中发挥重要作用。