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可传播性海绵状脑病(Transmissible spongiform encephalopathy, TSEs)也称为朊病毒病(Prion diseases),是一类可感染人类和多种动物罕见的致死性神经退行性疾病,包括人类的克-雅病(Creutzfeldt-Jakob disease, CJD)、吉斯特曼斯特劳斯综合症(Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome, GSS)、Kuru病、家族性致死性失眠症(Fatal familial insomnia, FFI),以及动物的羊瘙痒病(Scrapie)、牛海绵状脑病(Bovine spongiform encephalopathy, BSE)和鹿的慢性消耗性疾病(Chronic wasting disease, CWD)等,其中人类TSEs以CJD为主,包括散发型、遗传型、医源型及变异型四种形式。本文分为两部分,第一部分我们利用TMT标记法串联质谱技术对我国散发型克-雅病(sporadic CJD, sCJD)患者脑脊液(cerebrospinal fluid, CSF)及非CJD患者脑脊液全蛋白进行了蛋白质组学分析。随后利用鸟枪法串联质谱技术对上述样品进行了1～10kDa范围蛋白多肽的肽组分析。通过这些分析鉴定出的差异表达蛋白不仅有助于sCJD患者CSF中潜在生物标志物的筛选,更为深入研究朊病毒致病过程中CSF微环境蛋白的变化规律提供了科学线索。第二部分我们在分子水平证实了PrP能够与去整合素金属蛋白酶10(ADAM10)发生特异的相互作用,主要与成熟型的ADAM10(M-ADAM10),而不是ADAM10的前体(Pro-ADAM10)。 PrP-ADAM10复合物主要分布于细胞膜上。在朊病毒感染的神经细胞系和感染动物脑组织中内源性ADAM10的含量明显下降,并随潜伏时间的增加而减少。第一部分：克-雅病患者脑脊液蛋白质组学分析为检测sCJD和非CJD患者脑脊液中全蛋白表达差异,利用TMT标记法串联质谱技术对我国39例临床诊断sCJD和52例非CJD患者混合CSF进行了蛋白质组学分析。在sCJD及非CJD患者混合脑脊液中共鉴定出437种潜在蛋白,其中49种蛋白在95%置信区间内。差异分析结果显示在这49种蛋白中,相对非CJD组,临床诊断sCJD组中有12种表达显著上调蛋白,13种表达显著下调蛋白。根据差异表达蛋白进行的通路分析显示sCJD患者CSF中影响最大的通路是补体和凝血级联反应通路。随机选择6种CSF差异蛋白进行Western blot验证,结果表明这些蛋白在sCJD与非CJD组中具有与蛋白质组学分析相似的变化趋势。选择磷酸甘油酸变位酶1(上调)和α[-1-抗胰凝乳蛋白酶(下调)分别进行单样品的(24例CJD和24例非CJD)Western blot验证,结果也证实了与蛋白质组学相同的变化趋势。进一步,为了在sCJD患者脑脊液中搜寻大小为1-10kDa的潜在差异蛋白多肽,将40例临床诊断sCJD、32例非CJD具有痴呆症状及17例非CJD不具有痴呆症状的患者脑脊液样品分别等体积混合,并用弱阳离子交换色谱磁珠(MB-WCX)富集1-10kDa蛋白多肽。经胰酶酶解后,用反相-高效液相色谱-电喷雾-四级杆-质谱鉴定、分析富集后的蛋白多肽。结果显示根据各组鉴定的多肽分析,临床诊断sCJD、非CJD痴呆及非CJD非痴呆患者混合脑脊液中分别鉴定出42、53及47种蛋白。在蛋白种类方面,非CJD痴呆组(76.2%)比非CJD非痴呆组(57.1%)更接近l№床诊断sCJD组。最后,我们发现有9种蛋白质特异性分布于临床诊断sCJD组。这些数据显示CSF的蛋白质组学分析不仅促进了潜在的生物标志物的筛选,而且也可成为理解朊病毒致病过程中CSF微环境中蛋白成分变化的科学线索。第二部分：朊病毒感染中ADAM10变化的研究本研究中我们在体外实验中证实了去整合素金属蛋白酶10(ADAM10)能够剪切重组人朊蛋白。通过免疫共沉淀和间接免疫荧光实验发现了PrPC和ADAM10能够发生相互作用,这种相互作用不仪存在于多种体外培养的神经细胞系中,而且还存在于正常仓鼠和小鼠脑组织中。仅仅成熟的ADAM10(移除前肽域后)分了能够绑定天然的PrPc。在体外培养神经细胞系的膜组分中发现了大量的PrP-ADAM10的复合物。在朊病毒感染的SMB细胞模型中,内源性ADAM10的表达水平,尤其是成熟型ADAM10在膜组分中明显减少。免疫共沉淀实验证实在朊病毒感染的SMB-S15细胞的裂解液中未发现PrP-ADAM10的复合物,间接免疫荧光实验结果显示PrP和ADAM10在细胞膜上不存在共定位。而且,我们证实在263K感染终末期的仓鼠和ME7感染终末期的小鼠脑匀浆中,ADAM10的表达水平明显减少,并且随潜伏时间的增加而减少。我们的结果提供了内源性ADAM10和PrP相互作用的可靠分子基础,并且朊病毒感染过程中ADAM10的明显降低提示ADAM10在朊病毒复制和沉积过程中起到了重要的病理、生理作用。