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背景人泡沫病毒(human foamy virus,HFV)是一种含有最长的基因组且有独特特性的逆转录病毒。目前研究表明,HFV对人或灵长类动物仅维持长期的潜伏感染状态,而无明显的致病性。由于HFV的非致病性并具有可携带大量外源基因的特点,因此被人们视为具有重要潜在作用且安全性较高的基因载体,未来可应用于临床疾病的基因治疗。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)作为宿主中不能编码蛋白质的RNA,近年来被大量研究报道具有多种生物学功能,在不同疾病中存在差异表达,并且在多种病毒感染中发挥着重要的调控作用。然而,至今未见lncRNA在HFV感染中的相关研究报道。目的探究HFV感染293T细胞后,宿主lncRNA的差异表达情况;进一步通过对lncRNA的相关生物学功能、通路预测以及可能顺式或反式作用的基因预测,揭示宿主中lncRNA在HFV感染中的作用,并对其中具体的lncRNA进行初步的功能研究。方法1.分别将3组HFV感染和未感染的293T细胞样品送去生物公司(上海晶能生物技术有限公司)进行第二代RNA高通量测序,并对得到的RNA-seq结果进行分类注释,统计分析差异表达的lncRNA和mRNA。2.用qRT-PCR检测选取的6个差异表达的lncRNA在HFV感染的293T和HT1080两种细胞系中的表达情况,确定RNA-seq结果的可靠性,并用生物信息学软件RNAfold预测上述6个lncRNA的二级结构。3.利用生物信息学的方法深入探究与挖掘RNA-seq中GO/GOTM功能分析和KEGG通路分析的数据,并将lncRNA对于基因的顺式与反式作用调控网络进行分类。4.选取 2 种具体的差异表达的 lncRNA,lnc-RP5-1086D14.3.1-1:1(简称 lnc-RP5)和NONHSAG000101(简称lnc-NONH),分别设计筛选出有效siRNA克隆,并构建两者的过表达质粒,通过qRT-PCR实验和Western Blot实验检测两者对HFV反式激活因子Tas的表达调控,并用luciferase实验检测对于HFV内部启动子(internal promoter,IP)活性的作用。5.通过生物信息学软件RNA22 v2分别预测出lnc-RP5和lnc-NONH可能靶向的microRNA(miRNA),并用qRT-PCR实验检测两者过表达与下调对各自靶向的miRNA的影响效应。6.利用lnc-RP5的过表达与下调质粒,通过qRT-PCR实验和Western Blot实验检测其对基因Nothl在mRNA和蛋白水平的调控作用,并利用luciferase实验、qRT-PCR实验和Western Blot实验进一步证明Notch1蛋白对于HFV IP和反式激活因子Tas的调控作用。结果1.在HFV感染293T细胞中,大部分差异表达的lncRNA的长度都在10kb以内,且包含20个或以下的外显子;分类统计结果显示,顺义lncRNA占36.1%,反义lncRNA占2.3%,内含子lncRNA占2.3%,增强子lncRNA占0.5%,sRNAhost lncRNA 占 4.1%,双向 lncRNA 占 5.5%,基因间 lncRNA 占 49.3%。2.我们的结果显示,11336个lncRNA存在差异表达,包括4729个表达下调的lncRNA和6588个表达上调的lncRNA;此外,我们还发现61367个mRNA存在差异表达,其中30133个mRNA表达上调,31220个mRNA表达下调(注:有些差异表达但质量低的基因没有测其具体上下调倍数)。3.qRT-PCR实验验证的6个lncRNA中,2个lncRNA表达上调(NONHSAG000101 和 ENSG00000204054),另外 4 个 lncRNA 表达下调(ENSG00000227254、ENSG00000247095、NONHSAT135354 和lnc-RP5-1086D14.3.1-1:1),与 RNA-seq 结果基本保持一致,且这 6 个 lncRNA的二级结构都包含多个茎环结构。4.差异表达的lncRNA的GO功能主要富集在“负向调控内稳过程”、“细胞外”和“N-酰基甘露糖胺”等方面;其KEGG通路主要富集在“癌症通路”等通路,分别有409个和637个差异表达的lncRNA以顺式和反式作用的方式调控靶基因。5.lnc-RP5和lnc-NONH可以促进HFV反式激活因子Tas的表达和内部启动子(IP)的活性。6.lnc-RP5 和 lnc-NONH 分别可以促进 miR-129-5p 和 miR-34c-5p 的表达。7.miR-129-5p和miR-34c-5p都可以促进HFV内部启动子(IP)的活性。8.lnc-RP5可以抑制Notch1基因的表达,且Notch1蛋白可抑制HFV IP的活性和反式激活因子Tas的表达。结论1.通过第二代RNA高通量测序的方法,本研究首次对HFV感染293T细胞过程中,宿主lncRNA的差异表达做出全面的鉴定和分析,并且从生物学功能、相关通路和顺式或反式作用调控网络进行多方面预测。2.lnc-RP5 可通过 miR-129-5p/Notch1/HFV IP 轴促进 HFV 反式激活因子 Tas的表达。3.lnc-NONH可通过miR-34c-5p/HFV IP轴促进HFV反式激活因子Tas的表达。