【摘 要】
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目的环状RNAs(circular RNAs,circ RNAs)是一类具有共价闭合环状结构的非编码RNA,具有结构稳定、高度保守和组织发育阶段特异性表达等特性。Circ RNAs参与多种生物学过程,如miRNA海绵吸附功能。已有研究表明,circ RNAs与干细胞和生殖发育等过程密切相关。雌性生殖干细胞(FGSCs)是既具有自我更新又能分化为成熟卵母细胞的成体干细胞,目前关于circ RNAs调
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目的环状RNAs(circular RNAs,circ RNAs)是一类具有共价闭合环状结构的非编码RNA,具有结构稳定、高度保守和组织发育阶段特异性表达等特性。Circ RNAs参与多种生物学过程,如miRNA海绵吸附功能。已有研究表明,circ RNAs与干细胞和生殖发育等过程密切相关。雌性生殖干细胞(FGSCs)是既具有自我更新又能分化为成熟卵母细胞的成体干细胞,目前关于circ RNAs调控FGSCs的发育鲜有报道,因此探究其在FGSCs发育过程中的调控作用有助于深入认识生殖细胞的发育机制,同时为非编码RNA的机制研究增添新证据,为改善卵巢功能障碍等相关疾病诊治提供理论基础。方法使用RT-PCR、细胞免疫荧光等方法鉴定FGSCs;利用RNase R酶消化、Sanger测序等技术鉴定circ AKT3的反向剪接、共价闭合特征和成环位点;采用荧光原位杂交(FISH)验证circ AKT3在FGSCs中的亚细胞定位;CCK-8、Ed U和Annexin V-PE等方法检测circ AKT3对FGSCs活力、增殖和凋亡的影响;利用miRanda预测可能与circ AKT3互作的miRNA并用RT-q PCR进行验证;双荧光素酶实验验证circ AKT3与miR-9-5p以及miR-9-5p与AKT3的3’UTR的互作;RNA免疫沉淀(RIP)实验进一步确认circ AKT3与miR-9-5p以及miR-9-5p与AKT3的3’UTR的互作。结果CircAKT3通过外显子反向剪接形成环状结构并表达于FGSCs胞质中。CircAKT3过表达能显著促进FGSCs增殖;同时,circ AKT3敲低能抑制FGSCs增殖但不导致FGSCs凋亡。荧光素酶报告基因检测及RIP实验证实了circ AKT3与miR-9-5p以及AKT3的3‘UTR与miR-9-5p的互作。RT-q PCR结果显示circ AKT3过表达能显著提高FGSCs自我更新相关基因AKT3的表达,反之circ AKT3敲低显著降低AKT3的表达。结论CircAKT3通过ceRNA机制,吸附miR-9-5p,调控靶基因AKT3的表达,从而促进FGSCs自我更新。上述结果对研究其他circ RNAs调控FGSCs发育具有参考作用,以及为雌性不孕等疾病防治提供新视角。
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