子痫前期是一种妊娠特异性疾病,发病率约为3-5%,会引起孕妇高血压、蛋白尿和水肿,胎儿早产、宫内发育迟缓和窒息,居孕产妇和围生期胎儿发病率和死亡率首位。因子痫前期的发病机制不明,至今仍无法做到有效的防治,唯一的方法就是移除致病的胎盘,例如分娩。临床研究显示,子痫前期孕妇中血清25(OH)D的水平下降,而维生素D缺乏的孕妇患子痫前期的风险增加。因此,冬季因为由阳光的减少所致维生素D合成减少,孕妇患子痫前期的风险更高。动物实验也证实,低维生素D水平会导致孕鼠子痫前期的症状,包括高血压和胎盘功能下降等。然而,孕期补充维生素D是否会减轻子痫前期的症状?如有改善,这种改善与哪些生物大分子的活性变化有关,还未知。大鼠子宫胎盘灌注压下降(RUPP)模型可以模拟人类子痫前期的胎盘灌注压下降,引起与人类子痫前期相同的表型,是公认的子痫前期模型。因此,我们选取RUPP模型大鼠为研究对象,通过以下三个部分的研究:(1)观察子痫前期孕妇血清维生素D和胎盘维生素D受体的水平,以及与胎盘和胎儿生长发育的关系;(2)证明孕早期补充维生素D对RUPP大鼠子痫前期症状具有改善作用;(3)维生素D改善RUPP大鼠子痫前期症状的分子机制。通过上述三个部分的研究,证实孕早期补充维生素D可以改善RUPP大鼠的子痫前期症状,从组织器官水平寻找维生素D改善子痫前期症状的作用靶点和分子机制。为维生素D应用于临床子痫前期的防治提供实验依据。第一部分子痫前期孕妇血维生素D和胎盘维生素D受体的水平目的:分析子痫前期孕妇血维生素D以及胎盘维生素D受体水平与子痫前期不良结局的关系。方法:选取临床诊断为子痫前期的病例,收集子痫前期(PE组,25例)和正常妊娠妇女(NT组,32例)的母血,脐血和胎盘;测量母血中钙、磷、碱性磷酸酶的水平,母血和脐血中25(OH)D的水平;检测胎盘的VDR,CYP27B1,CYP24A1的水平;分析VDR mRNA表达和脐血中25(OH)D、胎盘重量、新生儿体重、身长的关系。结果:1 PE组和NT组孕妇临床指标比较正常妊娠孕妇(NT组,32例)平均年龄为28.31±4.62岁,子痫前期孕妇(PE组,25例)的平均年龄年龄为27.92±6.35岁,两组年龄无差异。两组具有可比性。1.1 PE组符合临床对子痫前期的诊断标准PE组血压明显升高(收缩压172.46±21.12 mm Hg,舒张压(115.67± 19.11 mmHg),NT组血压均在正常范围(收缩压112.67±11.68 mmHg,舒张压69.33±9.02mmHg)。两组比较有明显差异(P<0.01)。PE组均出现明显蛋白尿(1.83±0.34g/24h),NT组没有或仅有微量蛋白尿,两组比较有明显差异(P<0.01)。1.2 PE组的胎盘重量,新生儿的体重、身长等较NT组低PE组的胎盘重量较轻(494.12±88.18 g),与NT组孕妇(565.19±85.23g)比较,差异有统计学意义(P<0.05)。PE组与NT组新生儿的胎龄无明显差异。PE组胎龄36.03±2.16周,NT组胎龄38.62±2.16 周。PE组的新生儿体重明显下降(2.60±0.69kg),NT组的新生儿体重在正常范围(3.31±0.40kg),两组比较有显著差异(P<0.01)。PE组的新生儿身长低于正常范围(47.25±2.19 cm),NT组的新生儿身长在正常范围(50.00±1.20cm),两组差异有统计学意义(P<0.01)。表明PE组分娩的新生儿经常出现宫内发育迟缓和低出生体重。1.3 PE组和NT组孕妇血中钙、磷、碱性磷酸酶水平无明显区别PE组血清钙正常或在正常范围低限(2.09±0.20mmol/L),与NT组相比(2.17±0.10mmo1/L),血钙轻度下降,但没有统计学差异。PE组血清中磷、碱性磷酸酶水平轻度升高(分别为1.20±0.23mmol/L,157.1±49.7 mmol/L),但与 NT 组孕妇比较(分别为 1.17±0.18mmol/L,143.76±40.68 mmol/L),没有明显差异。2 PE组血清及脐血中25(OH)D浓度明显低于NT组PE组血清中25(OH)D浓度(35.21 ±6.65 nmol/L),较NT组孕妇的浓度(46.09±8.88nmol/L)低,两组差异有统计学意义(P<0.05)。PE组脐血中25(OH)D浓度(31.44±5.61 nmol/L),较NT组的浓度(42.00±14.96nmol/L)低,两组差异有统计学意义(P<0.05)。脐血中25(OH)D浓度与母血中25(OH)D浓度有很强的正相关(R=0.825,P<0.05)。表明,脐血中25(OH)D来源于母血。3 PE组和NT组胎盘中维生素D的代谢酶的改变与NT组相比,1α-羟化酶CYP27B1的mRNA表达在PE组胎盘中轻度下降,但差异没有统计学意义。同样,24-羟化酶CYP24A1基因的mRNA表达在PE组胎盘中也有下降趋势,但和NT组胎盘相比,差异无统计学意义。和NT组胎盘相比,VEGF的mRNA表达在PE组胎盘中明显下降,两组差异有统计学意义(P<0.05)。VEGF的mRNA表达水平与胎盘重量有一定的正相关(R=0.361,P<0.05)。4PE组胎盘维生素D受体(VDR)蛋白表达升高和NT组胎盘相比,VDR在PE组胎盘中的mRNA表达有一定程度的升高,但两组差异无统计学意义。Western blotting结果显示,PE组胎盘中VDR蛋白表达比NT组胎盘高。免疫组织化学的结果与之相符,VDR在PE组胎盘滋养层细胞中深染高表达。5胎盘中维生素D受体(VDR)mRNA水平与脐血25(OH)D,胎盘重量,新生儿出生体重和身长的关系胎盘VDR的mRNA水平与母血中25(OH)D水平无相关性(R=-0.130,P=0.322)。VDR的mRNA表达水平与脐血中25(OH)D水平呈一定的负相关(R=-0.405,P<0.05)。VDR的mRNA表达水平与胎盘重量有负相关(R=-0.523,P<0.05);与新生儿的出生体重和身长也呈一定的负相关(分别为 R=-0.419,P<0.05;R=-0.427,P<0.05)。小结:1子痫前期孕妇血清和脐血中25(OH)D处于低水平状态。2低水平的维生素D很可能与胎盘、胎儿生长发育不良有关。第二部分1,25(OH)2D改善RUPP大鼠模型母体及胎儿的妊娠结局目的:证明孕早期补充1,25(OH)2D可改善RUPP大鼠的不良妊娠结局。方法:使用三月龄SD孕大鼠建立子宫胎盘灌注下降模型(RUPP)。(1.08±0.06mmol/L,P<0.001)和 RUPP 组(1.14±0.10mmol/L,P<0.05)相比,均有明显的升高。提示大鼠子痫前期症状的缓解与给予1,25(OH)2D有关。2补充1,25(OH)2D可以改善RUPP大鼠母体的心、肾和胎盘组织损伤2.1补充1,25(OH)2D可以减轻心肌细胞线粒体的损伤心脏超声显示,和NP组相比,RUPP组大鼠的左心室舒张末期容积(227.03±59.86ulvs.282.20±37.68 ul,P<0.05),左心室收缩期内壁直径明显下降(3.23±0.57mm vs.3.81±0.66mm,P<0.05),左心室舒张期前壁厚度/体重(分别为 0.00446±0.00067 vs.0.00306±0.00062,P<0.05)、左心室收缩期后壁厚度/体重明显升高(0.01146±0.0016 vs.0.00819±0.00084,P<0.05)。但是,心脏射血分数在三组之间没有明显差异,表明在RUPP组大鼠中心功能损伤不明显。而且,这些数据在RUPP+VD组和RUPP组两组之间没有明显差异。大鼠心肌纤维的连接处称为闰盘,着色较深,在光镜下呈横形或阶梯状粗线。心肌细胞的核呈卵圆形,位于中央,有的含有双核。其胞浆比较丰富,多在核的两端处。在HE染色切片中,NP组,RUPP组,RUPP+VD组的大鼠心脏的结构无明显形态学差异。在电镜下,NP组的大鼠心肌细胞,含有粗、细两种肌丝和肌节,由粗、细肌丝形成肌丝束。细胞有分支,相邻肌纤维呈端端连接。心肌纤维核1-2个,椭圆形,常位于细胞中央。线粒体多,纵行排列,体积大,嵴密集。在心肌细胞的横切面上,可见心肌肌丝间有肌质网囊管和线粒体无规则分布。在RUPP组,有些心肌细胞的线粒体出现改变,其大部分嵴和部分膜融合、模糊,部分嵴消失。基质内明显水肿,可见大小不等的空泡。肌膜下胶原纤维明显增生、水肿。细胞器数量减少。局部核周水肿。RUPP+VD组,一部分心肌细胞的线粒体出现改变,线粒体少数嵴融合、模糊不清,核一侧基质内水肿,结缔组织明显水肿。表明给予1,25(OH)2D后,RUPP+VD组的线粒体损伤得到缓解。PCR结果显示,大鼠心脏中VDR的表达在三组之间没有明显差异。然而,作为VDR的下游基因,CYP24A1的表达在RUPP+VD组明显升高(P<0.05),提示线粒体结构损伤的改善与给予1,25(OH)2D有关,可能通过VDR的基因途径调节。2.2补充1,25(OH)2D减轻RUPP组大鼠肾小球损伤大鼠肾脏在光镜下可见肾小体和肾小管。肾小体由血管球和肾小囊组成。血管球是一团毛细血管簇,呈球状,位于肾小囊中。在石蜡切片HE染色照片中,和NP组相比,RUPP组中肾脏组织的肾小球萎缩,肾小囊囊腔增大。RUPP+VD组中肾小球无明显萎缩,表明给予1,25(OH)2D后,肾小球损伤减轻。在电镜下,NP组的大鼠肾小球滤过膜的三层结构分别为血管内皮细胞、基膜和足细胞。血管内皮细胞上有圆形小孔。内皮细胞之外有一层基膜,电镜下基膜可分三层,中层电子密度较大,称为致密层,两侧电子密度较小,为内、外疏松层。足细胞是肾小囊脏层的上皮细胞,结构特殊,胞体很大。足细胞从胞体伸出较大的初级突起,每个初级突起又分成指状次级突起,紧贴在基底膜外面。足突相互穿插成栅栏状。电镜图片显示,在RUPP组中,肾小球滤过膜出现损伤,表现为足突大部分融合,基膜高度增生,呈丘状隆起。给予1,25(OH)2D后,这些损伤在RUPP+VD组部分得到缓解,足突近一半融合,基膜轻度增生。与RUPP组相比,给予1,25(OH)2D后,RUPP+VD组的基膜增生和足突融合减轻。PCR结果显示,大鼠肾脏中VDR的表达在三组之间没有明显差异。然而,作为VDR的下游基因,CYP24A1的表达在RUPP+VD组明显升高(P<0.05),提示肾脏结构和功能的改善与给予1,25(OH)2D有关,可能通过VDR的基因途径调节。2.3补充1,25(OH)2D可以减轻RUPP组大鼠胎盘的滋养层细胞损伤大鼠胎盘从母面到子面分为蜕膜层、巨细胞滋养层、海绵滋养层和迷路滋养层。迷路滋养层中多为绒毛,呈树状分支,外层由滋养层细胞覆盖,轴心为富含血管的结缔组织。HE染色显示,在大鼠胎盘的各部分结构中,绒毛部分在三组之间的差异最大。和NP组相比,在RUPP组中,绒毛的滋养层细胞萎缩,核椭圆形,深染。给予1,25(OH)2D后,在RUPP+VD组中,滋养层细胞的萎缩减轻,核圆形,深染区减少。在电镜下,NP组的大鼠胎盘滋养层细胞,表面可见微绒毛,胞质结构致密,内可见线粒体、核糖体和高尔基复合体。其核大,着色淡,染色质颗粒细,核仁明显。和NP组相比,RUPP组的部分滋养层细胞核不规则,有的出现核轻度固缩,异染色质增多。细胞器数量(内质网、核糖体、线粒体等)明显减少,内质网扩张,线粒体嵴、膜部分融合消失,有髓样化表现。微绒毛明显减少,有的从细胞上脱出。RUPP+VD组,少部分滋养层细胞核不规则,异染色质轻度增多。线粒体轻度嵴、膜融合,微绒毛数量减少。与RUPP组相比,RUPP+VD组的细胞核形态较规则,异染色质减少,线粒体损伤减轻,微绒毛较多。PCR结果显示,和NP组和RUPP+VD组相比,大鼠胎盘中VDR的表达在RUPP组中升高(P<0.05)。作为VDR的下游基因,CYP24A1在三组之间的表达没有明显差异。由此推测,1,25(OH)2D可能在胎盘中通过VDR的非基因途径发挥作用。组化结果显示,在胎盘中,和其它部分相比,绒毛部分的VDR蛋白水平的表达更明显。RUPP组中绒毛的VDR表达比NP组升高,RUPP+VD组的表达更高。这些结果显示,胎盘结构和功能的改善,与VDR有关。3补充1,25(OH)2D可以降低RUPP大鼠母体的高血糖1,25(OH)2D可以降低RUPP大鼠的高血糖。试验发现,RUPP组普遍出现了高血糖(12.73±4.00 mmol/L),其血糖水平比NP组(8.05±2.81 mmol/L)明显升高,差异有统计学意义(P<0.01)。RUPP+VD组的血糖水平显著下降(10.01 ±2.09mmol/L,P<0.05)。RUPP组和RUPP+VD组的血脂水平出现改变。比较血清中总胆固醇含量,RUPP 组(1.43±0.16mmol/L)、RUPP+VD 组(1.62±0.30mmol/L)和NP组(2.03±0.27 mmol/L)相比,均有显著下降(分别为P<0.01,P<0.05)。血中甘油三酯水平,RUPP 组(0.90±0.53 mmol/L)和 NP 组(3.14±1.79 mmol/L)相比,明显下降(P<0.05)。RUPP+VD组中甘油三酯水平(1.60±0.69mmol/L)也较NP组下降,但无统计学差异。小结:妊娠早期给予RUPP大鼠1,25(OH)2D,有助于改善孕鼠及胎儿的妊娠结局。第三部分1,25(OH)2D通过抑制凋亡和上调自噬,减轻RUPP大鼠胎盘的滋养层细胞受损目的:证明1,25(OH)2D通过改善RUPP大鼠胎盘的滋养层细胞的氧化应激和内质网应激而抑制凋亡和上调自噬。方法:应用DHE检测大鼠胎盘中活性氧(ROS)水平,TUNEL法检测胎盘中细胞凋亡水平,应用Western blot和免疫组化法检测氧化应激、内质网应激、凋亡和自噬相关标志蛋白在大鼠胎盘中的表达。结果:1 1,25(OH)2D降低了 RUPP组大鼠胎盘的氧化应激水平与NP组相比,RUPP组的ROS水平升高。给予1,25(OH)2D后,RUPP+VD组的ROS水平降低。P47-phox作为氧化应激的标志物,它的mRNA和蛋白水平,在RUPP组升高。给予1,25(OH)2D后,P47-phox mRNA和蛋白水平降低。免疫组化显示,P47-phox主要在胎盘滋养层细胞的胞浆中表达(棕黄色颗粒)。表明1,25(OH)2D主要降低了 RUPP组大鼠胎盘滋养层细胞的氧化应激水平。2 1,25(OH)2D降低RUPP组大鼠胎盘的内质网应激水平免疫组化和western的结果显示,作为内质网应激的标志物GRP 78,CHOP和Caspase 12,它们的蛋白表达水平,在RUPP组胎盘中明显升高。给予1,25(OH)2D后,GRP 78,CHOP和Caspase 12的蛋白表达水平明显下降。免疫组化图片显示,GRP78、Caspase 12主要在胎盘滋养层细胞的胞浆中表达(棕黄色颗粒),CHOP主要在胎盘滋养层细胞的胞浆和胞核中表达。表明1,25(OH)2D主要降低了 RUPP组大鼠胎盘滋养层细胞的内质网应激水平。3 1,25(OH)2D降低了 RUPP组大鼠胎盘细胞的凋亡水平在荧光显微镜下,DAPI能将凋亡和未凋亡的细胞都染成蓝色。只在凋亡的细胞核中才有Bright Green掺入而产生的绿色荧光。重叠后的青色代表凋亡的细胞核。在NP组中,标记蓝色荧光的核较大,几乎没有凋亡的细胞核,表明凋亡细胞较少。在RUPP组中,可以看到部分细胞核萎缩,凋亡的细胞核散在出现,表明部分细胞出现凋亡。RUPP+VD组中,萎缩的细胞核减少,凋亡的细胞核也减少,表明发生凋亡的细胞减少。免疫组化结果显示,总Caspase3在RUPP组和RUPP+VD组中的表达都较NP组低,但1,25(OH)2D会明显降低活化的Caspase3的表达水平。这和TUNEL结果是一致的。Caspase 3和活化的Caspase3主要在胎盘滋养层细胞的胞浆和胞核中表达。表明1,25(OH)2D主要降低了 RUPP组大鼠胎盘滋养层细胞的凋亡水平。4 1,25(OH)2D增加RUPP组大鼠胎盘细胞的自噬水平Western的结果显示,与NP组相比,作为自噬标志物的Beclin 1和LC3B-Ⅱ的蛋白表达水平在RUPP组中降低,在RUPP+VD组中表达水平最高。免疫组化图片显示,Beclin1的蛋白表达,也在RUPP+VD组中增高。Beclin1和LC3B主要在胎盘滋养层细胞的胞浆中表达。表明1,25(OH)2D主要增加了RUPP组大鼠胎盘滋养层细胞的自噬水平。小结:1,25(OH)2D通过抑制凋亡和上调自噬,减轻RUPP大鼠胎盘的滋养层细胞受损,改善胎盘功能。结论:1子痫前期孕妇母血和脐血中低浓度维生素D与子痫前期的不良结局有关。2孕早期给予RUPP大鼠1,25(OH)2D,可以改善孕鼠子痫前期的不良结局。3 1,25(OH)2D通过抑制细胞凋亡和上调细胞的自噬,减轻RUPP大鼠胎盘的滋养层细胞损伤。