研究背景及目的 蛋白质酪氨酸残基的可逆磷酸化是正常生命活动和疾病转归中的关键机制，其磷酸化水平受酪氨酸激酶(PTKs)和酪氨酸磷酸酶(PTPs)的共同调节。由于许多PTKs是癌基因和生长因子受体，因此已得到了广泛而深入的研究，但PTPs的重要性直到最近十几年才得到充分的认识。 PCP-2是一种受体型酪氨酸磷酸酶(RPTPs)，由王红阳教授于1996年在国际上首先克隆并鉴定。与其它RPTPs不同点是其胞外区具有一个MAM(meprin／A5／PTPμ)功能域和胞内较长的近膜区。已证实MAM功能域参与非钙离子依赖的同源性粘附；而胞内近膜区具有与钙粘蛋白(E-cadherin)同源的结构域，E-cadherin通过该结构与β-连环蛋白(β-catenin)结合，后者通过结合α-连环蛋白(α-catenin)与细胞骨架(actin)相联系。β-catenin是一种具有双重功能的分子，它一方面参与细胞粘附，是细胞骨架的重要组份，另一方面又是Wnt途径的效应分子，与转录因子LEF／TCF结合后激活下游基因(C-Myc,CyclinD1等)表达，在发育和肿瘤发生中具有重要地位。 越来越多的证据表明可逆的酪氨酸磷酸化是调节E-cadherin／β-catenin复合体的粘附功能及β-catenin转录活性的重要机制。但目前国际上对RPTPs调控该复合体的研究较少，尤其是对β-catenin转录功能的调节尚无报道。前期我们研究发现PCP-2与该复合体共同定位于细胞联结部位，提示PCP-2可能参与对其功能的调控。本研究旨在通过对PCP-2与该复合体相互作用的研究，阐明PCP-2对细胞粘附和β-catenin转录活性的影响，为进一步揭示其在肿瘤发生及发育中的作用机制提供线索，并探讨其潜在的应用价值。 实验方法： 1．构建PCP-2和β-catenin不同结构功能部位的突变体质粒； 2．通过免疫沉淀和免疫印记研究PCP-2与E-cadherin／β-catenin复合体的相互作用； 3．运用荧光素酶报告基因系统检测PCP-2对β-catenin转录活性的作用； 4．建立稳定表达PCP-2的真核细胞系； 5．通过Boydern Chamber小室，划痕实验，细胞增殖实验和集落形成实验等观察PCP-2稳定表达对细胞粘附，迁移，生长和增殖的影响； 6．应用免疫沉淀，GST pulldown以及免疫荧光技术研究PCP-2对E-cadherin／β-catenin复合体稳定性的调节；第二军医大学中文摘要博士学位论文7.研究p一catenin在稳定表达PCP一2细胞中的胞内定位，转录活性及磷酸化状态的 改变; 8.通过裸鼠成瘤实验观察稳定转染PCP一2对肿瘤细胞SW480成瘤性影响:结果: 1.PcP一2与p一catenin特异性结合，二者结合不依赖p一catenin的磷酸化状态，并由 PCP一2近膜区及p一catenin梭基末端介导; 2.共转染激活的Src激酶，p一catenin和PCP一2及其磷酸酶突变体显示PcP一2可使 p一eatenin去磷酸化; 3.PCP一2下调野生型和组成激活型p一catenin转录活性，该作用依赖于 PCP一2磷酸 酶活性和近膜区结构: 4.PCP一2稳定转染SW480细胞系可显著抑制其迁移，增殖及集落形成能力等生物 学行为; 5.对该细胞系的进一步研究发现其p一catenin转录活性下调，E一cadherin表达水平 升高而游离的p一catenin下降，E一cadherin/p一catenin复合体稳定性提高，并伴随 p一catenin磷酸化水平下降; 6.裸鼠成瘤实验显示该细胞成瘤性显著下降。结论: 本研究首次发现受体型酪氨酸磷酸酶PCP一2与重要的肿瘤相关基因p一catenin相互作用，并证实PcP一2既可通过与p一catenin的直接结合，也可通过调节其磷酸化水平间接提高E一cadheri可p一catenin复合体稳定性，从而促进细胞间粘附，降低p一catenin转录活性，实现其抑制细胞迁移，增殖和转化的能力。