B7分子是表达在抗原递呈细胞表面的协同刺激分子，其中CD86(又称B7-2)和CD80(又称B7-1)为B7分子家族重要成员，为T细胞活化提供重要的协同刺激信号。T细胞的活化不但需要TCR识别抗原肽段所介导的特异性信号，还需要CD28分子结合抗原提呈细胞表面B7分子所提供的协同刺激信号，从而诱导T细胞增殖并分化，发挥正常免疫防御及调节功能。有研究表明，B系淋巴瘤细胞及多发性骨髓瘤细胞表面同时高表达CD86与CD28，在细胞间形成交互活化信号，导致此类肿瘤细胞的增殖与转移；进一步研究表明，抗体封闭该肿瘤细胞表面CD86分子可以有效遏制此细胞的增殖。本研究在已获得稳定分泌抗人CD86单克隆抗体杂交瘤的基础上，研制抗人CD86双价抗体，并研究其对协同刺激信号的阻断作用及对表达CD86的肿瘤细胞体内、外增殖的影响。第一部分抗人CD86双价抗体真核表达载体的构建及表达【目的】构建重组抗人CD86双价抗体真核表达载体，转染至CHO细胞中表达，分离培养上清，纯化CD86-diabody并鉴定其特性。【方法】从分泌抗人CD86鼠源抗体的杂交瘤1D1中克隆抗体重、轻链可变区基因VH及VL。通过SOE-PCR技术构建VH-(GGGGS)-VL双价抗体基因，再整合到真核表达载体pIRES2-EGFP中，以脂质体法转染CHO细胞，FCM筛选G418加压培养的阳性细胞克隆。大量培养该CHO细胞，IMAC法纯化细胞培养上清得到抗体，再用BCA法测定抗体浓度，最后通过SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色鉴定抗体双价性。【结果】构建了抗人CD86-diabody真核表达载体，筛选出一株具有稳定分泌抗人CD86-diabody能力的CHO细胞株，细胞培养上清中抗体纯品的得率为5.24mg/L，双价抗体分子量约为56kDa。【结论】构建了抗人CD86-diabody真核表达载体，在CHO细胞中成功表达，获得了稳定分泌抗人CD86-diabody的CHO细胞株，大量培养并纯化得到了双价抗体分子。第二部分抗人CD86双价抗体的生物活性研究【目的】研究CD86-diabody对细胞表面CD86分子的特异性识别及介导的生物学活性。【方法】通过免疫荧光技术分析CD86-diabody对人B系淋巴瘤细胞株Raji及Daudi膜型CD86分子的阳性结合率，并与抗CD86鼠源亲本抗体及单链抗体比较抗原结合特性；通过单向混合淋巴细胞反应研究CD86-diabody对CD86-CD28协同刺激信号的阻断作用；将CD86-diabody加入到Raji细胞培养体系中进行共培养，分析其对Raji细胞体外增殖的影响，并通过流式细胞术研究其对Raji细胞凋亡的诱导作用；Raji细胞经CD86-diabody孵育后，接种BALB/c裸鼠，观察其对肿瘤细胞体内成瘤的影响。【结果】CD86-diabody与Raji及Daudi细胞结合阳性率分别为77.2%及70.6%；竞争结合实验结果显示，CD86-diabody对亲本抗体及CD86-scFv与CD86结合抑制率为69.2%与56.7%；CD86-diabody阻断协同刺激信号后，对淋巴细胞增殖的抑制率为62.9%；CD86-diabody孵育后，Raji细胞体外增殖率下降了37%，凋亡率增加了17.0%；Raji细胞经CD86-diabody封闭后接种裸鼠，动态观察发现肿瘤形成延迟6-8天，肿瘤体积较对照组相比小约30%。【结论】研制的抗人CD86-diabody能特异性结合细胞膜型CD86分子，与亲本抗体有着相同的抗原结合特性，可阻断CD86-CD28信号的协同刺激作用并对表达CD86的肿瘤细胞体内、外增殖具有抑制效应。