低温诱导下苹果花药差异表达基因分析

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花药培养是苹果单倍体育种的主要技术方法之一,是指通过器官或者胚状体形成进而获得完整植株的过程。其中通过胚状体培养不仅能够直接分化成苗,而且成苗时间短、成活率高,并具有较高的再生效率;且在培养之前若对花药进行一定的时间低温预处理,能够诱导花药直接形成胚状体而不经过愈伤。本研究对不同时间低温预处理后的苹果花药,以及低温预处理后再经培养形成的胚状体和愈伤组织进行转录组测序,并对其中发生差异表达的基因进行研究,对影响低温诱导后苹果花药中小孢子获得胚性潜能的相关基因进行筛选,对相关基因与胚状体形成率的关系进行探讨。得到的结果如下:1.选择苹果品种’嘎啦’的花药为供试材料,从基因层面研究不同低温处理时间对苹果花药中小孢子胚性潜能获得的影响,确定6份供测序样品:T1(未处理花药)、T2(低温预处理10天的花药)、T3(低温预处理30天的花药)、T4(低温预处理30天后培养30天的花药)、T5(花药经低温预处理30天后培养形成的胚状体)、T6(花药低温预处理30天后培养形成的愈伤组织)。2.对6个样品进行转录组测序,共获得34.88 Gb的Clean Data,各样品的Clean Data均达到5.4 Gb,Q30碱基百分比在89.08%及以上。各样品的Clean Data和已知参考基因组进行序列比对,比对效率百分比在74.4%及以上。6份样品的测序质量均满足实验需求。3.根据本实验同的确定比较组为:T1—T2、T1—T3、T1—T4、T6—T5。四个比较组通过基因表达分析共获得21,851个差异表达基因,其中表达量上调基因个数为10,302,表达量下调基因个数为11,549。4.差异表达基因的GO注释结果显示,在"生物学过程"这一分组中差异表达基因的类型最多,且在这一大类别中的"细胞过程"、"代谢过程"两个小类的差异表达基因富集量比例最高;差异表达基因的COG直系同源分类结果显示,R(一般功能预测)类中基因数最多,其次为K(转录)、L(复制、重组、修复)、T(信号转导机制)、G(碳水化合物运输和代谢);差异表达基因的KEGG分类结果显示,差异表达基因所在代谢通路的功能最多集中在"代谢"。差异表达基因显著富集的代谢通路主要与激素信号转导和糖类代谢有关,其中富集量最多的代谢通路为"植物激素信号转导"与"淀粉和蔗糖代谢"。5.T1—T2、T1—T3、T1—T4组中,控制蔗糖合成和细胞分裂素、脱落酸、赤霉素、油菜素内酯信号转导的相关基因表达量上调,控制淀粉合成和生长素信号转导的相关基因表达量下调。T1—T4、T6—T5组中,控制蔗糖合成和淀粉合成的相关基因表达量均先下调后上调;控制生长素信号转导的相关基因表达量下调;控制细胞分裂素、赤霉素和脱落酸信号转导的相关基因表达量上调。6.荧光定量PCR结果显示,筛选出的关键差异表达基因表达量的实际变化趋势,与测序结果中的变化趋势完全一致。因此,本研究中所筛选出的差异表达基因在低温处理过程中,通过控制蔗糖、细胞分裂素、脱落酸、赤霉素、油菜素内酯相关基因表达量的增加,以及淀粉和生长素相关基因表达量的减少来提高胚状体形成率。而在胚状体形成后,与愈伤组织相比,蔗糖、淀粉、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸相关基因的表达量要高于愈伤组织,生长素相关基因表达量要低于愈伤组织。因而控制以上基因的表达量变化情况,是影响低温诱导后花药中小孢子胚性潜能获得的关键。
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