研究背景干细胞移植治疗在再生医学领域受到越来越多的关注,但是由于对干细胞在移植后的迁移、归巢、定植、分布等生物行为缺乏深刻的认识和理解以及非常有限的体内移植干细胞存活数量等原因,外源性干细胞移植治疗效果还有待进一步提高。因此,寻找一种能同时满足当前干细胞移植所面临的细胞标记示踪和细胞保护两方面需求的多功能材料,有利于促进干细胞移植治疗的发展。据检索,目前还没有这种多功能材料的相关报道。生物光学成像由于检测仪器发展成熟、灵敏度高、对比度高、分辨率高、成像直观、成像速度快和无损检测等优点被广泛应用于医学生物研究。依据检测方式的不同生物光学成像可分为荧光成像、生物发光成像、光声成像、光学断层层析成像等,其中活体动物体内光学成像主要采用生物发光成像与荧光成像。生物发光成像技术是用荧光素酶基因标记细胞或DNA,而荧光成像技术则采用荧光报告基团(GFP、RFP及Cyt等)或荧光染料进行标记。生物发光成像和部分荧光成像技术由于需要构建基因表达载体转染目标细胞,具有潜在的生物风险性,导致其在临床干细胞标记成像中的应用受到限制。而近红外(near-infrared,NIR)荧光染料标记技术由于较低的组织自发荧光和较强的组织穿透能力等特点,通过荧光染料标记可以对目标细胞进行实时、连续检测,在小动物活体成像方面具有广阔的应用前景,目前正逐步应用于细胞标记示踪研究。与量子点、碳点等无机近红外荧光材料相比,有机近红外荧光染料具有更高的荧光量子产率、结构易调、生物安全性好等优点而备受关注。但是,当前已有的包括吲哚菁绿(indocyanine green,ICG)在内的有机近红外荧光染料大都是亲脂性的细胞膜标记染料,标记效率较低,且在生物荧光成像过程中容易和体内蛋白等生物分子相互作用,存在着严重的细胞沾染以及潜在的细胞毒性作用,限制了这类染料在干细胞标记示踪中的应用。七甲川花菁染料是近红外荧光染料中的优秀代表,部分染料能够特异性地蓄积于细胞线粒体之中并具有良好的光学稳定性,多种七甲川花菁染料已经应用于生物活体中细胞标记与示踪成像研究。本课题组在之前的工作中,通过对七甲川花菁染料的化学结构进行修饰和改造,合成制备了一系列新型七甲川花菁荧光小分子化合物。通过结构学研究分析以及其他研究者的相关报道,确定这类七甲川花菁荧光小分子能够靶向蓄积于细胞线粒体之中;同时由于保留了七甲川花菁染料的近红外荧光特性,为用于细胞标记、活体示踪以及生物成像提供了基础。此外,此类七甲川花菁荧光小分子靶向蓄积于细胞线粒体之中,对线粒体功能产生一定影响,从而使细胞命运发生转变。基于当前干细胞移植治疗的迫切需求和本课题组以往的研究工作基础,发展出一种新的能够同时具有细胞标记示踪和细胞保护作用的七甲川花菁荧光小分子化合物,在干细胞治疗领域具有重要意义和潜在应用前景。研究方法1.多功能荧光小分子的合成与鉴定在以往的工作基础上,通过对七甲川花菁染料的七甲川核心周边N-烷基侧链进行结构修饰和改造,合成制备了一系列新的、保留了七甲川花菁染料细胞线粒体靶向蓄积和近红外荧光成像等原有特性的荧光小分子化合物。本研究从这些新型荧光小分子化合物中筛选出一种水溶性、荧光强度以及生物相容性较好,适用于干细胞示踪成像,同时还能够促进细胞表达抗氧化相关蛋白,增强细胞抗氧化应激损伤能力的多功能荧光小分子(NIR cell protector-61,NIRCP-61)。2.NIRCP-61用于间充质干细胞标记示踪成像利用原代分离培养的四种不同来源的间充质干细胞(mesenchymal stem/stromal cells,MSCs),包括人脐带间充质干细胞(h UCMSCs)、人真皮间充质干细胞(h DMSCs)、大鼠真皮间充质干细胞(r DMSCs)和小鼠骨髓间充质干细胞(m BMMSCs),通过近红外荧光显微镜观察和流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测确定NIRCP-61对MSCs的最佳标记条件和标记效率;分别采用CCK-8实验、Annexin V/碘化丙啶(propidium iodide,PI)细胞凋亡检测实验、细胞迁移实验、成骨诱导分化实验、成脂诱导分化实验检测在最佳标记条件下NIRCP-61对MSCs正常生理功能的影响;利用近红外荧光显微镜检测NIRCP-61标记细胞后6天内的荧光稳定性并使用激光共聚焦检测技术确定NIRCP-61标记在细胞内的亚细胞定位;建立放创复合伤小鼠模型,利用流式细胞术、激光共聚焦检测技术和小动物活体成像技术,通过体外细胞实验和体内动物实验分别检测NIRCP-61标记MSCs对周边非标记细胞和组织的沾染情况,以及标记细胞活体示踪成像情况。3.NIRCP-61对间充质干细胞抗氧化应激损伤的实验研究通过过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)处理或γ射线照射细胞,建立体外细胞氧化应激损伤模型,采用CCK-8实验、Annexin V/PI细胞凋亡检测实验和钙黄绿素/PI染色检测评价NIRCP-61减少H2O2处理造成的细胞活力降低、凋亡和死亡情况;采用集落形成实验、细胞核内γ-H2AX免疫荧光染色、中性彗星实验以及Western Blot检测评估NIRCP-61减轻电离辐射(ionizing radiation,IR)对细胞的损伤情况;采用流式细胞术和Western Blot检测NIRCP-61处理后细胞和线粒体活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成以及细胞内抗氧化相关蛋白的表达变化情况;通过Western Blot检测NIRCP-61处理后细胞内核因子2相关因子2/抗氧化反应元件(nuclear factorerythroid 2-related factor 2/antioxidant response element,Nrf2/ARE)和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide 3-kinase/proteinkinase B,PI3K/AKT)信号通路相关蛋白的表达变化情况;使用人Nrf2的小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA)以及PI3K的抑制剂LY294002反向验证Nrf2/ARE和PI3K/AKT信号通路在NIRCP-61促进细胞抗氧化应激损伤中发挥的作用。4.NIRCP-61促进间充质干细胞体内定植存活和组织修复的研究建立放创复合伤Sprague-Dawley(SD)大鼠模型和大剂量皮肤放射损伤大鼠模型,通过检测创面愈合速度、瘢痕形成质量、胶原形成情况以及观察皮肤水疱、脱屑以及坏死性溃疡形成等指标评估NIRCP-61促进间充质干细胞定植存活,减轻机体组织损伤,促进组织修复再生,提高细胞治疗潜能的情况;通过人工结扎大鼠冠状动脉左前降支建立急性心肌梗死大鼠模型,分组治疗4周后进行超声心动图检测、心脏取材固定后进行2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色、免疫组织化学染色以及Masson染色检测NIRCP-61促进间充质干细胞在大鼠体内定植存活,减少左心室梗死面积,减轻组织纤维化形成,维持心脏正常功能的情况。研究结果1.通过对七甲川花菁染料进行化学结构修饰、改造,合成制备了一系列新型近红外荧光小分子化合物,并从中成功筛选出新型荧光小分子(NIRCP-61),其水溶性和生物相容性好、标记效率和荧光强度高,并且能够同时满足细胞移植治疗对细胞标记示踪成像和细胞保护两方面的需求。2.荧光小分子NIRCP-61保留了七甲川花菁染料良好的近红外荧光以及细胞线粒体靶向蓄积的特性,体外细胞标记过程简便易行,无需额外的转染试剂或操作步骤即可完成。同当前已有的其它近红外荧光探针相比,NIRCP-61标记效率高,生物相容性好,并且标记细胞对周边细胞和组织微环境的非特异性沾染明显减少,显著提升了荧光信号的特异性,在干细胞标记示踪成像中的应用前景更佳。3.荧光小分子NIRCP-61能够减轻过氧化氢处理造成的细胞活力降低,减少细胞凋亡;维持电离辐射后干细胞的成集落能力;免疫荧光染色、中性彗星实验以及Western Blot检测结果证明NIRCP-61可明显减少IR造成的细胞DNA损伤;ROS检测结果显示,NIRCP-61处理能显著降低过氧化氢或IR处理引起的细胞内ROS水平升高,减轻过量ROS对细胞造成的损伤;Western Blot检测结果表明,NIRCP-61的细胞保护作用是通过活化细胞内Nrf2和PI3K/Akt信号通路,激活细胞内源性抗氧化还原反应通路,促进细胞高表达一系列内源性抗氧化蛋白而实现。4.在三种动物损伤模型中证明荧光小分子NIRCP-61能够显著减轻机体内氧化应激微环境对移植干细胞造成的损伤,促进移植细胞在机体病损部位及周边组织内的定植和存活,减轻组织损伤和纤维化程度,加速创伤愈合,改善瘢痕形成质量,促进组织修复与再生,提高细胞移植治疗的效果。研究结论据检索,这种同时具备近红外荧光成像和细胞保护功能的荧光小分子尚属首次报道。线粒体靶向的NIRCP-61对不同种类的MSCs均具有优异的标记性能,适合用于干细胞的示踪成像;且能显著减轻氧化应激对MSCs造成的损伤,促进MSCs移植后在生物体内的定植存活,减轻组织损伤,减少纤维化形成,促进机体组织修复与再生,提高细胞治疗潜能。因此,近红外荧光小分子NIRCP-61代表了一类新颖的、可提高细胞移植治疗效果的治疗性荧光探针,在干细胞治疗的临床转化中具有潜在的应用前景。