结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)属消化道常见的恶性肿瘤之一,在全世界所有恶性肿瘤中,其发病率居第三,死亡率居第二。CRC严重威胁着人们的健康与生命。研究表明CRC的发生发展与饮食、遗传及环境等诸多因素密切相关。现今CRC的临床治疗,常用外科手术切除、化疗、放疗及靶向治疗。随着对CRC认识深入及治疗方法的不断改进,使得CRC的死亡率降低,五年生存率提高,患者的生存质量得到明显改善。CRC发生部位隐匿,早期诊断困难,目前,CRC尚未鉴定出特异性诊断标志物,亦缺乏行之有效的诊断方法,多数患者前来就诊时已为中晚期,临床上对中晚期结直肠癌的治疗效果难尽人意。随着分子生物学的发展与研究技术的进步,肿瘤发病分子机制探讨不断深入,肿瘤分子病理学亦得以迅速发展,人类在部分肿瘤早期诊断及治疗方面取得了可喜成就。但CRC发生发展分子机制仍待阐明。因此,揭示CRC的发病分子机制,是寻找CRC早期特异性诊断标志物及临床治疗新靶点的关键所在,亦对提高疗效、改善患者生存质量均具有重要意义。近年来,长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)以其在细胞生命进程与肿瘤生物学中的重要调控作用,受到了人们的广泛关注。lncRNA是一类长度大于200bp,传统上不作为蛋白质翻译的模板,而是以RNA形式直接行使功能的RNA分子。lncRNA可以在转录、转录后、翻译及翻译后修饰等多个水平上参与细胞的增殖、分化、发育等生物学进程,从而在表观遗传、胚胎发育及肿瘤的发生发展等生理活动中发挥调控作用。研究表明lncRNA在多种肿瘤的发生发展中起着重要的调控作用,在CRC中,已发现lncRNA可以通过参与多种信号通路的调控从而影响肿瘤细胞发生上皮间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)或者细胞周期阻滞,进而影响肿瘤细胞的生长凋亡和迁移侵袭。此外,还有部分lncRNA可以参与到肿瘤的的化疗耐药性以及放疗敏感性。然而,目前基于高通量测序手段对CRC中的lncRNA进行系统鉴定和功能研究的相关报道很少,本研究采用高通量测序鉴定和筛选在CRC中高表达的lncRNA,并对其生物学功能、分子机制以及临床意义进行分析,以期寻找CRC早期诊断标志物和药物治疗新靶点。内质网(Endoplasmic Reticulum,ER)稳态对细胞正常的生理活动是至关重要的。在正常情况下,BIP与位于ER膜上的应激信号感受蛋白IRE1,ATF6和PERK结合形成复合物,使三种感受蛋白处于无活性状态。然而,当细胞处于异常的生理状态如缺氧、炎症、钙离子水平失调等条件下,就会诱发ER压力。ER压力会导致细胞内未折叠蛋白质的累积,使得BIP转而结合ER中不断增多的新生未折叠蛋白,从而导致三种感受蛋白从BIP复合物中解离出来,引起未折叠蛋白质反应(Unfolded Protein Response,UPR)信号通路的激活,加速蛋白质折叠和错误折叠蛋白质的清除。分子伴侣蛋白BIP(GRP78/HSPA5)是ER应激时迅速产生的主要保护蛋白,被公认为ER应激最敏感的标志蛋白之一。在肿瘤组织中,由于肿瘤细胞的生长较快,对营养物质的需求较大,因此肿瘤细胞长期处于缺氧、酸中毒、营养缺乏等微环境中,研究表明,肿瘤细胞可以激活UPR信号通路,通过上调ER分子伴侣蛋白的表达,促进蛋白质的折叠以及错误折叠蛋白质的清除来恢复ER稳态,使其耐受缺氧、酸中毒以及营养不良的不利因素,减少细胞凋亡,促进肿瘤的发展和耐药,甚至诱导肿瘤细胞的免疫耐受。综上所述,lncRNA作为细胞内重要的调控因子,在恶性肿瘤包括CRC的发生发展中发挥着重要的调控作用,然而目前在CRC中差异表达的lncRNA还没有被广泛鉴定出来,分子机制也尚不明确。因此,在本研究中,使用临床CRC组织样本,系统的鉴定在癌组织中差异表达的lncRNA。随后功能研究表明其中一条lncRNALUCRC(LncRNA Upregulated in Colorectal Cancer,LUCRC),对CRC细胞的生长增殖,迁移侵袭以及肿瘤形成都具有重要的影响。机制研究表明LUCRC可以参与到ER中UPR信号通路的调控,并且可以调控UPR靶基因如BIP的表达。进一步研究表明LUCRC可以在CRC患者血浆中检测到,具有一定的临床意义。第一部分差异表达lncRNA筛选目的:通过RNA-seq分析CRC组织中差异表达的lncRNA,并筛选有功能的lncRNA。方法:收集临床CRC患者的肿瘤组织和癌旁组织样本进行RNAseq,随后通过生物信息学手段系统性的分析CRC组织中差异表达的基因,并选取文献已知的在CRC中高表达的mRNA,通过UCSC可视化分析和RT-qPCR验证测序数据的真实性。接下来对差异表达的基因进行功能注释,KEGG通路分析以及HALLMARK分析。随后对CRC差异表达的lncRNA进行生物信息分析,并通过RT-qPCR对在肿瘤组织中显著高表达的10条lncRNA进行验证,并使用TCGA数据库分析其在临床组织中的表达情况。通过细胞增殖实验对筛选出的lncRNA进行功能检测,筛选出对CRC细胞生长增殖具有重要影响的lncRNA。结果:生物信息学分析显示大量的基因在CRC中差异表达,包括文献已有报道的基因如MYC,CCND1。基因功能注释和通路分析显示差异表达的基因显著的富集与癌症相关的功能和通路中。RNAseq鉴定到了上百个差异表达的lncRNA,RT-qPCR验证以及TCGA数据库分析表明了这些lncRNA在肿瘤组织中高表达的真实性。细胞增殖实验表明其中一条lncRNA LUCRC对CRCHCT116细胞的生长增殖具有显著的影响。小结:CRC中存在大量差异表达的lncRNA,其中在CRC组织中高表达的LUCRC对细胞增殖具有显著的影响。第二部分LUCRC的功能目的:探究LUCRC的分子特征,以及对CRC细胞体外的生长增殖,迁移侵袭和体内成瘤的影响。方法:利用核糖体图谱分析实验检测LUCRC的编码潜能,使用核质分离结合RT-qPCR的方法检测LUCRC的核质定位。采用siRNA或者shRNA干扰LUCRC,通过流式细胞术,细胞增殖实验,克隆形成实验,伤口愈合实验以及小室侵袭实验,检测LUCRC对HCT116细胞的细胞凋亡,细胞增殖能力,克隆形成能力,迁移和侵袭能力的影响。使用shRNA干扰的HCT116细胞进行裸鼠体内的成瘤实验,检测LUCRC对小鼠体内肿瘤形成的影响。在RKO和DLD1细胞系中检测LUCRC对细胞增殖的影响。分析LUCRC在临床结直肠肿瘤组织和癌旁组织,以及TCGA数据库中结直肠肿瘤组织间的表达差异。结果:核糖体图谱分析和核质分离实验显示LUCRC不具备编码能力,并且主要定位于细胞质中。体外的细胞周期、克隆形成、细胞增殖、伤口愈合实验和小室侵袭实验发现LUCRC干扰后可以显著的诱导HCT116细胞的凋亡,抑制细胞的增殖,迁移和侵袭能力。通过动物实验发现LUCRC干扰后可以显著抑制HCT116细胞在裸鼠体内的成瘤能力。LUCRC也可以抑制RKO和DLD1细胞的增殖。通过临床肿瘤样本和TCGA数据库分析表明LUCRC在结直肠肿瘤组织中显著高表达,并且不同分期肿瘤之间的表达无显著差异。小结:LUCRC是一条对CRC细胞的生长增殖,迁移侵袭和成瘤具有显著影响,并且在CRC组织中高表达的lncRNA。第三部分LUCRC的作用机制目的:通过RNA-seq分析LUCRC调控的靶基因,探讨其在细胞内参与的信号通路。方法:通过对HCT116细胞转染siCTL和siLUCRC后,提取细胞总RNA进行RNA-seq,利用生物信息学的手段分析LUCRC调控的基因群,并探讨LUCRC在细胞内参与的生理进程以及调控的信号通路。RT-qPCR验证LUCRC对UPR反应中重要的伴侣蛋白BIP的调控。PCR和western blot检测LUCRC干扰对衣霉素(Tunicamycin,TM)诱导的UPR通路中XBP1的剪接和ATF6切割活动的影响。使用CRC临床样本和TCGA数据库分析LUCRC的靶基因BIP在CRC组织中的表达情况。结果:RNA-seq对LUCRC调控的基因群体进行分析发现,LUCRC可以显著的调控ER中蛋白质的折叠进程以及ER应激反应,并且BIP为其重要的一个靶基因。LUCRC干扰后可以抑制TM诱导的UPR信号通路中XBP1的剪接和ATF6的切割。通过临床肿瘤样本和TCGA数据库分析表明BIP在结直肠肿瘤组织中显著高表达,并且不同分期肿瘤之间的表达无显著差异。小结:LUCRC可以参与到ER中UPR信号通路的调控,并且可以调控UPR靶基因BIP的表达。第四部分结直肠癌患者血浆中LUCRC表达分析目的:检测LUCRC在临床CRC患者血浆和健康对照血浆中的表达,探讨LUCRC的临床意义。方法:收集CRC患者和健康志愿者的外周血液样本,分离出血浆后提取RNA,检测LUCRC在血浆中的表达差异。结果:在7个健康志愿者的血浆中,有6个几乎检测不到LUCRC的存在,而在7个CRC患者的血浆中都可以检测到LUCRC的表达,并且显著高于健康志愿者血浆中的表达小结:LUCRC在CRC患者血浆中表达,并且其表达水平显著高于健康对照。结论1、从结直肠癌组织中,筛选出190个差异表达lncRNA,表达上调56个,表达下调134个。2、LUCRC基因在结直肠癌中高表达,可促进细胞生长增殖、迁移侵袭及裸鼠成瘤能力。3、LUCRC通过调控UPR信号通路中BIP表达,发挥其生物学功能。4、结直肠癌患者血浆中LUCRC基因高表达。