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大黄鱼（Larimichthys crocea）是我国重要的海水养殖经济鱼类,养殖产量自2014年以来一直处于我国海水养殖鱼类品种之首。随着现代高密度集约化养殖模式的发展,生产上先后爆发了多种大黄鱼养殖病害。其中,由杀香鱼假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）感染引起的大黄鱼内脏白点病,因发病率高、致死性强,已成为威胁大黄鱼养殖产业健康发展的主要细菌类病害。目前,生产上一般使用恩诺沙星或盐酸多西环素对该病进行防控,但临床效果不稳定,且容易诱生耐药菌株,给该病的防控造成潜在威胁。因此,亟需开发一种绿色、高效的防治方法。疫苗作为一种生物防控手段,具有安全、高效的优点,目前已广泛应用于水产养殖病害防控。然而,现已报道的关于大黄鱼源杀香鱼假单胞菌的在研疫苗存在着保护效果不强、安全性不够高（如减毒活疫苗）等不足。因此,设计、筛选出一种更为安全、高效的候选疫苗对于大黄鱼产业发展具有重要意义。菌蜕是革兰氏阴性菌在噬菌体Phi X174裂解基因E的作用下发生穿孔性裂解,形成不含内容物、没有活力的菌体空壳结构。该结构保留了几乎与活菌一样的表面抗原结构（含抗原决定簇和免疫粘附因子等）,能够有效诱导宿主产生体液免疫与细胞免疫应答,因而可作为一种理想的候选疫苗组分,具有开发成候选疫苗、佐剂、或疫苗载体等潜力。本研究基于现有理论基础,在商品化温控表达质粒p BV220的基础上,通过基因工程技术,导入噬菌体裂解基因E和卡那霉素抗性筛选标记,构建形成新的温控裂解质粒220E-Kn,将其先后导入大肠杆菌（Escherichia coli）和大黄鱼源杀香鱼假单胞菌,对其诱导菌蜕形成的能力进行了评估。结果表明:220E-Kn质粒在大肠杆菌中可稳定传代并在42℃时启动裂解基因的高效表达,诱导4 h后,大肠杆菌的裂解穿孔率达到99.997%,扫描电镜结果显示,大肠杆菌菌体发生了裂解、收缩和内容物外泄等结构变化。通过电转化法将220E-Kn质粒导入杀香鱼假单胞菌,获得阳性转化子,经28℃培养和42℃温控诱导,结果表明,220E-Kn质粒在卡那霉素筛选压力下,可在杀香鱼假单胞菌中稳定传代,溶菌动力学显示,42℃诱导24 h,杀香鱼假单胞菌的裂解率达到100%,扫描电镜观察发现菌体中间凹陷,两端出现明显的穿孔裂解现象,将诱导24 h后的菌液于TSA培养基上复苏培养48 h,无菌落形成,表明裂解完全无活菌存留。为准确评价菌蜕的免疫保护效果,本研究首先对杀香鱼假单胞菌感染大黄鱼的模型进行了初步研究。在20℃～25℃的水温条件下,将杀香鱼假单胞菌分别以腹腔注射和浸泡方式感染健康大黄鱼（35±5 g）,结果显示,两种方式均可引起有效感染和死亡,其中,浸泡感染引起死亡的趋势更接近自然感染的发病死亡规律,且发病鱼的脾脏均出现典型的白点症状,而注射感染死亡过于迅速、集中,且平行组之间重复性较差,因而,本研究确立以浸泡感染为主要方式的感染模型。同时,为确定低温条件下杀香鱼假单胞菌的致病力,开展了低温（10℃～13℃）条件下的浸泡感染实验,结果表明,10℃～13℃水温条件下,浸泡感染大黄鱼（35±5 g）的半数致死剂量LD50=1.3×10~4 CFU/m L。为评估菌蜕疫苗的免疫保护率,参照感染模型数据,以2×10~4CFU/m L的剂量分别对甲醛灭活疫苗和菌蜕疫苗进行免疫后28天攻毒,结果表明,菌蜕苗免疫组14天的相对保护率（Relative percentage survival,RPS）为66.67%,甲醛灭活苗的RPS为46.67%,菌蜕苗优于甲醛灭活苗。为进一步评价杀香鱼假单胞菌菌蜕对大黄鱼的免疫保护效果,本研究对3个实验组（PBS对照组、甲醛灭活疫苗组、菌蜕疫苗组）大黄鱼定期采样,采集血清、头肾和脾脏,对先天及后天免疫相关参数进行监测,包括血清中特异性抗体水平、碱性磷酸酶（AKP）和酸性磷酸酶（ACP）活性、脾脏和头肾中免疫相关因子Ig M、IL-1β、MHCIα、MHCIIβ、CD4和CD8基因的相对表达量水平。结果显示,菌蜕疫苗诱导的血清抗体水平在10周免疫期内均高于PBS和甲醛灭活疫苗,且在第8、10周显著高于甲醛灭活苗组（P＜0.01）;脾脏中Ig M转录水平在第6周显著高于甲醛灭活苗组（P＜0.01）;AKP和ACP活性在第8周显著高于甲醛灭活苗组（P＜0.05）。细胞免疫相关因子监测数据显示,菌蜕苗诱导的IL-1β在头肾和脾脏中均呈现先升高后降低的趋势,并且在第4、6周均显著高于甲醛灭活苗组（P＜0.01）。此外,CD4和CD8在头肾和脾脏中呈现不同的表达变化:头肾中CD4和CD8的转录水平呈现逐渐下降的趋势,其中CD4在第2、4周显著高于甲醛灭活苗组（P＜0.01）;脾脏中CD4在免疫周期内无显著性变化,CD8呈现先升高后降低的趋势,并在第4周显著高于甲醛灭活苗组（P＜0.05）。综上,本研究成功构建了一种大黄鱼源杀香鱼假单胞菌菌蜕的温控诱导株,在42℃温度下诱导24 h,可获得裂解完全的菌蜕。免疫保护效果评估结果表明,菌蜕疫苗的RPS为66.67%,高于甲醛灭活苗（46.67%）。同时,相关免疫参数监测结果显示,菌蜕可诱导更强、更持久的先天及后天免疫,有望成为一种安全、高效的候选疫苗。