论文部分内容阅读
本试验根据GenBank登录的金鱼(AF454389)、鲤鱼(AB332394)、斑点叉尾鮰(AB196449)和斑马鱼(EU908736)的ghrelin基因序列的同源性和保守区设计并合成了特异性引物,利用RT-PCR方法从鲫鱼肠道总RNA中扩增出为490bp的目的片段。将目的基因克隆到pMD19-T载体上,序列测定结果表明与ghrelin基因ORF区完全一致。序列分析表明：获得了长490 bp的ghrelin蛋白基因(GenBank登录号HM567312),其序列含1个312 bp的完整开放阅读框,编码103个氨基酸；ghrelin蛋白理论相对分子质量为11519.48道尔顿,等电点为5.20,半衰期为1.20h,不稳定系数为31.29,总平均亲水性为0.727,疏水性介于-2.900～2.856；在1～26位氨基酸可能是信号肽序列；在ghrelin分子序列中存在44处α螺旋富集区域,8处β折叠区域,集中于成熟肽部分,有43处无规则卷曲。系统进化树分析显示鲫鱼ghrelin基因与金鱼进化距离最近,高达99.0%。利用荧光定量技术发现：鲫鱼ghrelin基因在肠道、肝脏和中肾的表达量高,并且肠道的表达量最高；鲫鱼ghrelin基因在头肾、脑垂体、肌肉和脾脏中的表达量一般；在皮肤、心脏和鳃中没有检测到ghrelin基因mRNA的表达。利用primer5.0软件,分别在ORF上下游设计一对分别带限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点的上、下游特异引物,采用PCR技术,以鲫鱼ghrelin基因克隆载体为模板,扩增出成熟蛋白的编码基因(248 bp),并将其插入pET-32a(+)表达质粒,构建了鲫鱼ghrelin成熟蛋白原核表达质粒。阳性重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)重组质粒经PCR、酶切鉴定及测序验证后转化大肠杆菌Rosetta (DE3),经IPTG诱导,重组蛋白成功表达,表达蛋白的分子量约27.0KD,诱导温度为37℃,重组蛋白以可溶性蛋白和包涵体两种形式存在。试验确定鲫鱼ghrelin重组成熟蛋白表达的最佳条件为IPTG 0.3 mmol/L,37℃诱导培养4 h,鲫鱼ghrelin重组成熟蛋白表达的相对含量达到42.6%。本试验首次克隆鲫鱼ghrelin基因,并通过对基因序列改造后经原核表达出鲫鱼ghrelin融合蛋白,这为进一步研究鲫鱼ghrelin在体内外的作用,并为研究其生理活性的作用提供了条件。