研究背景肺癌是世界范围内最常见的一种恶性肿瘤,其发病率和死亡率逐年升高。肺癌中约80-85%为非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC),主要包括鳞状细胞癌、腺癌、大细胞癌及其他少见的腺鳞癌、类癌和支气管腺体癌等,临床中最常见的为前两者。对于早期非小细胞肺癌,手术治疗仍是首选的治疗方法,但约超过一半以上患者在就诊时已属晚期,失去了手术机会,放化疗成为这部分患者的主要治疗方法,但五年生存率仍不满意。随着对肿瘤分子生物学的不断深入研究,分子靶向治疗(molecular targeted therapy)正逐步成为恶性肿瘤综合治疗不可或缺的一部分。近年来在肺癌分子靶向治疗方面研究颇多,部分针对如表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)的靶向药物已被批准已用于晚期肺腺癌患者,在临床中已取得可观的疗效。靶向治疗正引领着肺癌治疗逐步走向个体化治疗的新里程,因此不断深入探索新的生物靶点,对肺癌个体化治疗及提高五年生存率起着十分重要的意义。上皮间质化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)是指上皮细胞失去其上皮特性,获得了间质细胞的特性,从而具备降解细胞外基质的能力和较强的迁移能力。越来越多的研究证明,上皮间质化被认为是与恶性肿瘤侵袭、远处转移密切相关的一个过程,目前已经成为肿瘤靶向治疗药理研究的一个重要靶点。研究表明,与上皮间质化紧密相关的一个信号通路是TGF-β(transforming growth factor,TGF-β)信号通路,而胚胎成形素Nodal蛋白属于TGF-β信号传导超家族,原本是一种重要的细胞成形素,能调控细胞的生长和分化,随着生长发育正常组织中表达逐渐减少。然而,研究表明在乳腺癌、前列腺癌、肝癌等多种恶性肿瘤中都可以检测到Nodal蛋白的表达。进一步的研究还发现,Nodal蛋白参与调控这些恶性肿瘤的增殖、侵袭和远处转移,且和预后有密切关系,故Nodal很可能可以作为影响恶性肿瘤预后的一个重要因素,也可能是恶性肿瘤分子靶向治疗中一个新的靶点。目前,Nodal蛋白在肺癌中研究极少,为了解其在肺癌中是否也存在表达,本研究将检测临床非小细胞肺癌组织标本中Nodal的表达情况,并分析Nodal的表达与临床分期、病理分化程度等临床因素的相关性,并进行体外细胞实验,检测肺腺癌细胞株A549中Nodal的表达情况,以及从上皮间质化角度进一步探索Nodal与非小细胞肺癌转移的相关机制。第一部分人非小细胞肺癌组织中Nodal蛋白的表达及临床意义目的:研究Nodal蛋白在人肺鳞状细胞癌和肺腺癌中的表达及临床意义。方法:收集我院心胸外科2012年1月~2014年6月肺癌术后标本94例,其中鳞状细胞癌24例、腺癌70例,选取肺大泡切除术后正常肺组织20例作为对照组。采用免疫组织化学染色检测Nodal蛋白在肺鳞癌、腺癌和正常肺组织中的表达情况,并通过统计学分析了解Nodal蛋白的表达与患者年龄、性别、吸烟史、病理分化程度、临床分期、淋巴结转移及寡转移等临床相关因素的相关性。结果:免疫组织化学染色结果显示,Nodal蛋白在肺鳞状细胞癌中阳性表达率为33.3%(8/24),对照组阳性表达率为10%(2/20),两者之间无统计学差异(p>0.05);Nodal蛋白在肺腺癌中阳性率为84.3%(59/70),与对照组之间有明显的统计学差异(p<0.05)。在肺腺癌中,中-高分化者和未-低分化者的Nodal蛋白的阳性表达率分为76.7%(33/43)和96.3%(26/27),两者之间有统计学差异(p<0.05);临床分期为I-II期者和III-IV期者的Nodal阳性表达率分别为71.9%(23/32)和94.7%(36/38),两者之间有统计学差异(p<0.05);伴和不伴淋巴结转移者Nodal阳性表达率分别为92.8%(39/42)和71.4%(20/28),两者之间有统计学差异(p<0.05);伴和不伴寡转移者Nodal阳性表达率为96.2%(25/26)和77.3%(34/44),两者之间有统计学差异(p<0.05)。肺腺癌中男性39例,女性31例,阳性表达率分别为89.8%和77.4%,两者之间无统计学差异(p>0.05);年龄小于50岁者和大于等于50岁者的阳性表达率分别为85.7%和83.7%,两者之间无统计学差异(p>0.05);有和无吸烟史者的阳性表达率分别为76.0%和88.9%,两者之间无统计学差异(p>0.05)。结论:Nodal蛋白在肺腺癌中的阳性表达率明显高于正常肺组织,而在肺鳞癌中表达与正常肺组织无差异。在肺腺癌中,Nodal蛋白的阳性表达率与腺癌分化程度、临床分期、是否淋巴结转移和寡转移相关,分化程度越低、临床分期越晚、伴淋巴结转移及寡转移,Nodal蛋白的阳性表达率越高;而与患者的年龄、性别及是否吸烟不相关。第二部分肺腺癌细胞株A549中Nodal蛋白的表达目的:检测肺腺癌细胞株A549细胞中Nodal蛋白的表达。方法:1、肺腺癌细胞株A549细胞的复苏、培养及传代。2、采用传代培养的A549细胞行免疫细胞化学染色、Western blot,检测Nodal蛋白表达,以正常肺泡上皮细胞为对照组。结果:免疫细胞化学染色可见肺腺癌细胞株A549细胞质内有黄褐色的颗粒物质,染色中等阳性(++),且阳性细胞多,对照组正常肺上皮细胞染色为阴性,Western blot显示A549的Nodal蛋白印记为灰色条带,对照组未见条带。结论:Nodal蛋白在肺腺癌细胞A549中高表达,而在正常肺泡上皮细胞中为阴性表达。第三部分Nodal诱导肺腺癌转移的分子机制目的:探索Nodal诱导肺腺癌侵袭及转移的分子机制。方法:1.通过体外r Nodal干预传代培养的A549细胞,观察Nodal诱导的细胞形态学变化;2.收集经体外r Nodal干预培养至12h、24h及48h的A549细胞,提取各时段的总蛋白,行Western blot,分析Nodal刺激后A549细胞上皮标志物E-cadherin及间质标志物Vimentin表达的变化趋势;3.通过细胞划痕试验和Transwell细胞侵袭试验,分析Nodal对A549细胞的迁移和侵袭能力的影响;4.收集通过体外r Nodal干预后培养至15、30及60分钟的A549细胞,提取各时段的总蛋白,行Western blot,分析Nodal刺激A549细胞三个时段Smad2的磷酸化水平。结果:1、正常A549细胞呈现多边形、鹅卵石样紧密排列生长。经r Nodal干预后24h细胞逐渐变成不规则的狭长、梭形或纺锤形,且有伪足形成,48 h后最明显,细胞呈涡旋状排列,且具有一定的时间依赖性。2、上皮标志物E-cadherin的表达随r Nodal刺激时间的延长呈现逐渐下降的趋势,而间质标志物Vimentin的表达则相反呈持续上升的趋势。3、划痕试验24h开始各组于划痕区可见迁移的细胞,48h后r Nodal刺激组迁移细胞的数目最多,Nodal抑制剂SB组迁移的细胞数最少,Nodal组迁移细胞的数目明显多于对照组(p<0.05);Transwell侵袭试验48h后各组均观察到肿瘤细胞穿越仿生基底膜,r Nodal组中穿越进入下室生长的细胞数量比对照组和SB组明显多(p<0.05)。4、通过体外A549细胞进行r Nodal干预后,Smad2的磷酸化蛋白水平在检测时间内随着时间的推移而逐渐升高。结论:Nodal可以促进A549细胞发生形态学的变化,由上皮向间质细胞形态改变,并有一定的时间依赖性,能促进A549细胞上皮标志物表达减少,间质标志物表达增多而介导A549细胞上皮间质化,提高A549细胞的迁移和侵袭能力,小分子抑制剂SB431542能抑制其迁移能力,促进Smad细胞信号通路的活化。