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目的：构建携带自杀基因、能够选择性在肝癌细胞中复制、并杀伤肝癌细胞的新型腺病毒载体，研究该载体在肝癌细胞及正常肝细胞中的复制与杀伤能力，以及联合应用前药丙氧鸟苷（GCV）后对肝癌细胞杀伤效果的改善情况，为肝癌基因治疗提供一种新的载体和工具。
方法：以肝细胞癌HepG2细胞基因组DNA为模版，PCR扩增甲胎蛋白基因（AFP）5’端300bp核心启动子顺序（AFPp），以及被截短了的但包含两个亚区的800bp增强子顺序（AFPe）。以增强型绿色荧光蛋白（EGFP）及萤火虫荧光蛋白（luc）的融合基因（EGFPluc）作为报告基因，构建表达质粒pAFPp-EGFPluc和pAFPe-AFPp-EGFPluc，通过检测报告基因EGFP和Luciferase的表达鉴定AFPp和AFPe的活性，在质粒水平上检验含有启动子和增强子顺序的人工启动子AFPe-AFPp是否比单独的AFPp有更高的活性和特异性。分别构建由AFPp或AFPep调控E1A表达的穿梭质粒pDC311-AFPp-E1A、pDC311-AFPep-E1A以及由AFPep调控E1A表达并携带自杀基因TK的穿梭质粒pDC311-AFPep-E1A-CMV-TK，而后利用AdMax腺病毒包装系统分别包装出腺病毒Ad.AFPp-E1A、Ad.AFPep-E1A和Ad.AFPep-E1A-CMV-TK。利用Western blotting、病毒增殖测试、细胞病变、细胞活力等鉴定并比较Ad.AFPp-E1A和Ad.AFPep-E1A在选择性复制能力和溶瘤作用方面的差异，在病毒水平上检验AFPep调控E1A的重组腺病毒是否比AFPp调控E1A的重组腺病毒有更好的选择性；利用Western blotting、病毒增殖测试、细胞病变、病毒联合前药GCV对肝癌细胞的杀伤实验等鉴定重组腺病毒Ad.AFPep-E1A-CMV-TK的选择性复制能力和溶瘤作用。
结果：⑴通过检测报告基因EGFP和Luciferase的表达，发现AFPp和AFPep在肝癌细胞均具有一定的活性和特异性，其中AFPep的活性和特异性更为明显。⑵Ad.AFPp-E1A、Ad.AFPep-E1A感染人肝癌细胞（HepG2）以及正常肝细胞（chang liver细胞）后，Western bloting检测ElA表达，检测结果表明在AFP阳性的HepG2肝癌细胞中Ad.AFPp-E1A、Ad.AFPep-E1A均有ElA蛋白表达，而在AFP阴性的chang liver正常肝细胞中，Ad.AFPp-E1A、Ad.AFPep-E1A均没有检测到ElA蛋白表达；在感染了Ad.AFPep-E1A的HepG2细胞中E1A的表达量明显高于感染了Ad.AFPp-E1A的HepG2细胞。⑶Ad.AFPp-E1A、Ad.AFPep-E1A感染人肝癌细胞（HepG2和Hep3B），人非小细胞肺癌细胞（NCIH460），以及正常肝细胞（chang liver细胞）后，通过病毒增殖测试实验发现Ad.AFPp-E1A及Ad. AFPep-E1A在人肝癌HepG2、Hep3B细胞中的复制能力明显高于在非肝癌来源的肿瘤细胞（NCIH460）及正常肝细胞中的复制能力。⑷通过细胞病变实验发现Ad.AFPp-E1A和Ad.AFPep-E1A对AFP阳性细胞均具有一定的溶瘤作用，其中后者的溶瘤作用更为明显。⑸通过细胞杀伤实验发现，感染了Ad.AFPp-E1A的HepG2、Hep3B细胞的存活率分别为(54.23±7.13)％、(61.18±12.63)％；而感染了Ad.AFPep-E1A后的HepG2、Hep3B细胞的存活率分别为(26.65±5.43)％、(24.49±3.31)％。与正常肝细胞对照相比，感染了Ad.AFPp-E1A、Ad.AFPep-E1A的肝癌细胞其生长明显受到抑制，其中Ad.AFPep-E1A抑制细胞生长的作用更为明显。⑹通过Western blotting、病毒增殖测试证明带有自杀基因TK的腺病毒载体Ad. AFPep-E1A-CMV-TK具有在AFP阳性细胞中选择性复制的能力，通过细胞病变实验证明该病毒自身具有一定的溶瘤作用。⑺Ad. AFPep-E1A-CMV-TK联合GCV后对AFP阳性的HepG2和Hep3B肝癌细胞的杀伤作用增强。以非复制型腺病毒Ad.GFP作为对照，单独使用Ad. AFPep-E1A-CMV-TK、以及Ad.AFPep-E1A-CMV-TK联合GCV后HepG2、Hep3B细胞的存活率如下：HepG2细胞分别为(99.11±5.94)％、(25.56±1.23)％、(10.35±1.07)％；Hep3B细胞分别为(97.29±5.32)％、(24.54±7.30)％、(15.49±5.80)％。
结论：采用AFP基因启动子及截短了的AFP基因增强子顺序作为调控元件，调控腺病毒复制所需的早期基因E1A表达，成功构建了肝癌选择性复制型腺病毒载体。与其他研究工作相比，我们所构建的AFP人工启动子具有良好的肝癌选择性，并为腺病毒载体插入治疗基因提供了更多的空间；本研究不拘泥于单一的病毒疗法，还在复制型腺病毒中加入了TK自杀基因，有机结合了复制型腺病毒的溶瘤作用与自杀基因的基因治疗作用，这种协同效应，使该病毒具有更好的特异性和杀伤效果，为肝癌的治疗提供了新的载体和方法。