论文部分内容阅读
目的：研究二烯丙基二硫(DADS)对人白血病HL-60细胞中cofilin1表达以及其增殖、迁移、侵袭与分化的影响，并探讨其作用的分子机制。方法：RT-PCR和Western blot检测DADS对HL-60细胞中的cofilin1及p-cofilin1表达的影响以及信号通路Rac1-ROCK1-LIMK1中各因子表达的改变。通过细胞转染技术，将高表达cofilin1基因的重组质粒pcDNA3.1-CFL1-IRES2-EGFP稳定转染HL-60细胞，构建高表达cofilin1的HL-60/pcDNA3.1/cofilin1-EGFP细胞系。RT-PCR和Western blot检测转染后HL-60细胞cofilin1表达的变化，并观察DADS对高表达cofilin1的HL-60细胞中cofilin1表达的影响；NBT细胞还原实验、CCK-8增殖检测实验、Transwell迁移和侵袭实验以及细胞免疫荧光观察DADS对HL-60细胞及高表达cofilin1的HL-60细胞生物学特性的影响；RT-PCR和Western blot检测DADS对高表达cofilin1的HL-60细胞Rac1-ROCK1-LIMK1信号通路的影响。结果：1. DADS对HL-60细胞的cofilin1表达的影响RT-PCR和Western blot显示，DADS作用HL-60细胞0h、6h、12h、24h、48h后，cofilin1和p-cofilin1在mRNA表达水平和蛋白表达水平表现为时间依赖性的下降(P<0.05)。2. DADS对HL-60细胞增殖、迁移、侵袭及还原能力的影响NBT还原实验显示，DADS处理24h、48h、72h后，细胞对硝基蓝四唑的还原能力表现为时间依赖性的增强(P<0.05)。CCK-8实验显示，DADS可呈时间依赖性的抑制HL-60细胞的增殖(P<0.05)。Transwell迁移和侵袭实验显示，DADS处理后，HL-60细胞的迁移、侵袭能力可呈时间依赖性下降(P<0.05)。DADS组与ATRA组无统计学差异(P>0.05)。3. DADS对高表达cofilin1的HL-60细胞中cofilin1表达的影响构建高表达cofilin1的真核表达载体pcDNA3.1-CFL1-IRES2-EGFP，稳定转染HL-60细胞，RT-PCR和Western blot显示，转染cofilin1的高表达载体的后，HL-60细胞中cofilin1mRNA和蛋白表达水平与未转染组及阴性转染组细胞比较明显上升，表明HL-60/pcDNA3.1/cofilin1-EGFP细胞系构建成功。RT-PCR与Western blot显示，DADS处理前后，未转染组、阴性转染组及高表达组细胞的cofilin1和p-cofilin1在mRNA和蛋白表达水平具有统计学差异(P<0.05)。4. DADS对高表达cofilin1的HL-60细胞的分化的影响NBT实验结果显示，DADS分别处理未转染组、阴性转染组和高表达组细胞24h后，HL-60细胞对硝基蓝四唑的还原能力较未处理组细胞明显增强(P<0.05)；高表达组细胞较未转染组及阴性转染组细胞的还原能力明显降低(P<0.05)，DADS组与ATRA组无统计学差异(P>0.05)。CCK-8实验结果显示，DADS处理后，未转染组、阴性转染组及高表达组细胞的增殖能力较未处理的各组均减弱，且未转染组和阴性转染组细胞较高表达组细胞的增殖抑制更明显(P<0.05)。DADS处理组与ATRA处理组无统计学差异(P>0.05)。表明高表达cofilin1可以减弱DADS对HL-60细胞的增殖抑制作用。Transwell迁移和侵袭实验结果显示，DADS分别处理未转染组、阴性转染组及高表达组细胞后，其细胞穿过膜和基质胶的数量较未处理的各组细胞均减小(P<0.05)，未转染组和阴性转染组较高表达组穿过膜和基质胶的细胞数减少更明显(P<0.05)。DADS组与ATRA组无统计学差异(P>0.05)。表明高表达cofilin1可以减弱DADS对HL-60细胞的迁移、侵袭抑制作用。细胞免疫荧光结果显示，DADS处理后，未转染组、阴性转染组及高表达组细胞的CD11b蛋白表达水平较未处理的各组明显上升，CD33蛋白表达水平较未处理的各组明显下调。5. DADS对HL-60细胞中的Rac1-ROCK1-LIMK1信号通路的影响RT-PCR和Western blot结果显示，DADS作用HL-60细胞0h、6h、12h、24h、48h后，Rac1、ROCK1、LIMK1及p-LIMK1的mRNA和蛋白表达水平表现为时间依赖性的下降(P<0.05)。6. DADS对高表达cofilin1的HL-60细胞的Rac1-ROCK1-LIMK1通路的影响RT-PCR和Western blot结果显示，DADS处理后，未转染组、阴性转染组和高表达组细胞的Rac1、ROCK1、LIMK1及p-LIMK1的mRNA和蛋白表达水平较未处理的各组均显著下降(P<0.05)。DADS处理后的高表达组细胞较DADS处理后的未转染组和阴性转染组细胞的Rac1、ROCK1、LIMK1、p-LIMK1的mRNA和蛋白表达水平没有显著变化(P>0.05)。结论：1. DADS可下调cofilin1活性，抑制HL-60细胞增殖、迁移与侵袭及诱导分化。2．DADS拮抗Rac1-ROCK1-LIMK1通路下调cofilin1表达与磷酸化，抑制HL-60细胞增殖、迁移与侵袭及诱导分化。