细菌性脑膜炎(Bacterial meningitis)是严重威胁人类生命的感染性疾病,近年来,随着广谱抗菌药物的广泛使用、神经外科手术和各种创伤性操作的大量开展,医院获得性细菌性脑膜炎(Nosocomial bacterial meningitis)的发病率呈现明显上升趋势,细菌性脑膜炎病原体的分布也发生变化,革兰阴性菌,尤其是不动杆菌属、克雷伯菌属成为医院获得性细菌性脑膜炎的重要病原体。近年来,细菌耐药问题日益严峻,不动杆菌属、克雷伯菌属中碳青霉烯类耐药菌株逐渐增多,给抗感染治疗带来极大困难,细菌性脑膜炎的治疗面临严峻挑战。医院获得细菌性脑膜炎是一种严重的医院获得性感染,可由颅脑手术或侵入性操作(如脑室外引流、腰椎穿刺术及硬膜外腔阻滞麻醉等引起,常为神经外科术后的严重并发症,病死率可高达35%。目前医院获得性细菌性脑膜炎的确诊仍需依靠病原学检查,但由于细菌培养对操作要求较高、留取标本前经验性应用抗菌药物等原因,目前细菌性脑膜炎的病原学诊断率较低,有研究对2031份临床诊断为细菌性脑膜炎的脑脊液标本进行检测,发现细菌培养阳性率仅3.1%。有研究显示,发生医院获得性细菌性脑膜炎的危险因素有脑外科手术、脑室外引流、脑脊液漏等。目前国内关于细菌性脑膜炎的病原体分布及耐药性的报道较少,亦较少有医院获得性脑膜炎的相关临床资料报道。华山医院是大型三甲医院,神经外科有260张床位,年手术量超过15000台,为国内手术量最大的两家医院之一,70%-80%患者来自全国各省市及亚太地区。庞大的患者数量和手术量为医院获得性脑膜炎的相关研究创造了条件。本课题收集华山医院2004年1月到2013年12月10年间脑脊液分离的全部菌株,进行菌种分布、耐药性研究、β-内酰胺酶检测及同源性分析；并收集病史资料进行病例对照研究,分析医院获得脑膜炎的危险因素,以期对医院获得性脑膜炎的预防和治疗提供理论依据。第一部分2004-2013年华山医院脑脊液分离菌的分布及革兰阴性菌的药物敏感性我们收集了复旦大学附属华山医院2004-2013十年间脑脊液中分离到的全部菌株,统计脑脊液分离菌的分布情况,并用琼脂稀释法测定抗菌药物对革兰阴性菌的最低抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration, MIC),包括肠杆菌科及不动杆菌属细菌对20种抗菌药物的药物敏感性,以及铜绿假单胞菌对12种药物、其他非发酵糖革兰阴性菌对16种药物的敏感性,根据2013年版CLSI (Clinical and Laboratory Standard Institute)药敏标准判定结果,统计革兰阴性菌对各种抗菌药物的敏感率华山医院十年间脑脊液中共分离到526株非重复临床分离菌,其中97.8%为医院获得性感染。其中革兰阳性菌占35.9%(189/526),革兰阴性菌占64.1%(337/526)。最常见的分离菌依次为不动杆菌属(28.9%)、凝固酶阴性葡萄球菌(22.1%)、克雷伯菌属(14.6%)、铜绿假单胞菌(7.6%)、金黄色葡萄球菌(5.5%)和肠球菌属(5.3%)。2004-2013年间,克雷伯菌属构成比呈明显上升趋势,在分离菌中的构成比由2004年的14.3%上升到2013年的28.3%；不动杆菌属构成比在2009年之前呈上升趋势,于2009年达到最高,占所有分离菌的45.8%,此后构成比逐年下降,2013年降至15.1%；铜绿假单胞菌构成比总体呈下降趋势,2004、2005年的构成比构成比分别为8.6%、16.7%,2012、2013年则分别为3.7%和7.5%。由于在革兰阳性菌中,凝固酶阴性葡萄球菌所占比例高(61.4%,116/189),而脑脊液标本分离到凝固酶阴性葡萄球菌不能排除污染可能,同时由于纸片法药敏结果显示十年间革兰阳性菌在菌种分布、耐药性方面无明显变化,因此我们在此后的研究中主要对革兰阴性菌的菌种分布、耐药性及临床资料进行进一步分析。在337株革兰阴性菌中,除去遗失或死亡的菌株,本研究共收集到存活的革兰阴性菌267株,其中有肠杆菌科细菌97株,非发酵糖革兰阴性菌170株。肠杆菌科细菌包括克雷伯菌属68株、大肠埃希菌14株及其他肠杆菌科细菌15株,非发酵糖革兰阴性菌包括不动杆菌属细菌125株、铜绿假单胞菌25株、嗜麦芽窄食单胞菌14株及其他非发酵糖革兰阴性菌6株。药物敏感性试验结果显示,肠杆菌科细菌对第三、四代头孢菌素敏感率普遍较低,对碳青霉烯类药物的敏感率则在不同菌种中有较大差异。肠杆菌科中,68株克雷伯菌属(包括63株肺炎克雷伯菌及5株产酸克雷伯菌)对头孢噻肟、头孢他啶的敏感率分别为14.7%和25.0%,对碳青霉烯类药物敏感率亦较低,对亚胺培南、美罗培南敏感率分别为63.2%和66.2%。14株大肠埃希菌对头孢噻肟、头孢他啶敏感率分别为14.3%和42.9%,对碳青霉烯类药物敏感率则相对较高,对亚胺培南、美罗培南敏感率均为92.9%。非发酵糖革兰阴性菌中,125株不动杆菌属(包括93株鲍曼不动杆菌、20株醋酸钙不动杆菌、11株洛菲不动杆菌以及1株琼氏不动杆菌)对包括碳青霉烯类药物在内的各种常用抗菌药物耐药率均较高,对亚胺培南、美罗培南敏感率分别为49.6%和52.8%。25株铜绿假单胞菌对哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦、阿米卡星、环丙沙星的敏感率相对较高(敏感率均在72%-88%之间),对亚胺培南、美罗培南的敏感率分别为52.0%和88.0%。十年间,脑脊液主要革兰阴性菌对碳青霉烯类药物敏感性均呈明显下降趋势,克雷伯菌属对美罗培南的敏感率由2004年的100.0%下降至2013年的30.0%,不动杆菌属对美罗培南的敏感率由2004年的88.9%降到2013年的16.7%。第二部分脑脊液分离不动杆菌属、克雷伯菌属细菌的β-内酰胺酶检测及同源性分析第一部分研究结果显示,脑脊液分离菌中最常见的革兰阴性杆菌为不动杆菌属、克雷伯菌属。发现脑脊液分离不动杆菌属对碳青霉烯类药物及其他各种抗菌药物的耐药率均较高,克雷伯菌属对碳青霉烯类药物及第三、四代头孢菌素耐药率较高。产β-内酰胺酶是不动杆菌属和克雷伯菌属对p-内酰胺类抗生素耐药的主要机制之一,为了解脑脊液分离不动杆菌属和克雷伯菌属菌株产β-内酰胺酶情况,我们采用PCR方法检测62株碳青霉烯类不敏感不动杆菌属产碳青霉烯酶情况,并检测全部68株克雷伯菌属产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)以及其中30株碳青霉烯类不敏感菌株产碳青霉烯酶情况。结果显示62株碳青霉烯类不敏感不动杆菌(包括55株鲍曼不动杆菌、3株醋酸钙不动杆菌及4株洛菲不动杆菌)产OXA型碳青霉烯酶为主,其中以OXA23-like为最多(82.3%,51/62),产OXA24-like和OXA58-like碳青霉烯酶的菌株分别占1.6%和3.2%。此外检测到1株醋酸钙不动杆菌及1株为洛菲不动杆菌产NDM-1型碳青霉烯酶,1株洛菲不动杆菌产SIM型碳青霉烯酶。68株克雷伯菌属(包括63株肺炎克雷伯菌和5株产酸克雷伯菌)中,产ESBLs菌株占27.9%,以产CTX-M型为主,其中以产CTX-M-9.组菌株最多(19.1%,13/68),产CTX-M-1组菌株有11.8%(8/68)。68株克雷伯菌属菌株共检出5株(7.4%)产质粒介导的AmpC酶。在30株碳青霉烯类不敏感的克雷伯菌属菌株(包括28株肺炎克雷伯菌和2株产酸克雷伯菌)中,产KPC-2型碳青霉烯酶为76.7%(23/30),未检出IMP、VIM、NDM等碳青霉烯酶基因型。本研究第一部分显示,我院不动杆菌属构成比于2009年前持续上升,并于2009年出现高峰,而克雷伯菌属构成比于2012-2013年出现明显升高。为了解是否存在单克隆菌株传播流行,对不动杆菌属和克雷伯菌属进行同源性分析,采用ERIC-PCR方法对全部93株鲍曼不动杆菌进行分型,并采用PFGE方法对构成比显著上升的200%2009年三年间分离到的31株鲍曼不动杆菌、9株醋酸钙不动杆菌和5株洛菲不动杆菌进行分型；对于全部63株肺炎克雷伯菌则采用MLST方法分型。ERIC-PCR吉果显示93株鲍曼不动杆菌共分为6个型,以A、B、C三种克隆为主,所占比例分别为60.2%、17.2%和11.8%,其他三型共占10.8%。PFGE结果显示,2007-2009年间收集到的31株鲍曼不动杆菌分属23个PFGE-DNA谱型,9株醋酸钙不动杆菌分属8个PFGE-DNA谱型,5株洛菲不动杆菌为5个不同的PFGE谱型,未发现单一克隆菌株广泛流行传播情况。而对肺炎克雷伯菌进行MLST分型发现,ST-11型菌株在2010-2013年间构成比出现明显上升,其中2012、2013年两年分离到的23株肺炎克雷伯菌中,ST-11型占43.5%(10/23),提示单克隆菌株传播流行可能。第三部分鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌中枢神经系统感染的临床特征分析及病例对照研究医院获得性细菌性脑膜炎是一种严重的医院获得性感染,其主要病原体与社区获得性脑膜炎有很大差异,本研究中,鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌为医院获得性脑膜炎的最重要病原菌,构成比分别占全部革兰阴性菌的45.1%和22.8%。为了解鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌所引起的医院获得性脑膜炎的疾病相关情况、转归及危险因素,我们分别收集了105例鲍曼不动杆菌中枢神经系统感染患者(其中59株鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类耐药、46株对碳青霉烯类敏感),以及54例肺炎克雷伯菌中枢神经系统感染患者(包括24株肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类耐药、30株对碳青霉烯类敏感)的临床资料,对这些患者的一般情况、疾病相关情况(手术史、基础疾病、临床表现、治疗等)及转归进行分析。对于鲍曼不动杆菌或肺炎克雷伯菌中枢神经系统感染,分别进行两项回顾性病例对照研究,第一项病例对照研究的病例组为医院获得性鲍曼不动杆菌中枢神经系统感染的患者,对照组从与病例组同时期同病房住院,但脑脊液未分离到鲍曼不动杆菌的人群中按1：1比例随机抽取,以了解医院获得性鲍曼不动杆菌中枢神经系统感染的危险因素；第二项病例对照研究的病例组为医院获得性碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌中枢神经系统感染的患者,对照组为医院获得性碳青霉烯类敏感鲍曼不动杆菌中枢神经系统感染的患者,以了解医院获得性碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌感染的危险因素。肺炎克雷伯菌中枢感染的病例对照研究设计同鲍曼不动杆菌。结果显示,105例医院获得性鲍曼不动杆菌中枢神经系统感染患者和54例医院获得性肺炎克雷伯菌中枢神经系统感染患者大部分来自神经外科,分别占72.3%和81.5%,此外中心ICU患者分别占11.4%和9.3%,绝大部分患者有神经外科手术史,分别占96.2%和96.3%。105例鲍曼不动杆菌感染患者治疗有效率为56.2%(59/105),其中21例(20.0%)达到临床治愈,14例(13.3%)患者在住院期间死亡。54例肺炎克雷伯菌感染患者治疗有效率为75.9%(41/54),其中20例(37.3%)达到临床治愈,5例(9.3%)患者在住院期间死亡。肺炎克雷伯菌感染患者的治疗有效率和治愈率均显著高于鲍曼不动杆菌感染患者(P=0.015,P=0.020),院内死亡率则未发现显著性差异(P=0.674)。59例碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌(CRAB)感染患者与46例碳青霉烯类敏感鲍曼不动杆菌(CSAB)感染患者相比,临床症状等方面未发现显著性差异,预后方面,CRAB感染患者治疗有效率为44.1%(26/59),显著低于CSAB组的71.7%(33/46)(P=0.005),CRAB组治愈率为10.2%(6/59),亦显著低于CSAB组的30.4%(14/46)(P=0.009)。24例碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌感染患者与30例碳青霉烯类敏感肺炎克雷伯菌感染患者相比,临床症状等方面亦未发现显著性差异；预后方面,耐药菌株感染组中75.0%(18/24)患者临床治疗有效,敏感菌株感染组中76.7%(23/30)患者临床治疗有效,两组无显著性差异(P=0.887)；两组患者中达到临床治愈的比例分别为29.2%(7/24)和43.3%(13/30),亦未发现显著性差异(P=0.284)。病例对照研究中,Logistic逐步回归分析结果显示,鲍曼不动杆菌中枢神经系统感染的独立危险因素为脑室外引流(P=0.002)、脑外科手术次数(P=0.000)、全身麻醉次数(P=0.004)和气管切开(P=0.001)；碳青霉烯类耐药曼不动杆菌(CRAB)中枢神经系统感染的独立危险因素为分离耐药菌株前碳青霉烯类药物的使用(P=0.001)、抑酸剂的使用(P=0.008)、气管切开(P=0.026)和前期住院史(P=0.009)。肺炎克雷伯菌中枢神经系统感染的独立危险因素为脑室外引流(P=0.001)和静脉置管(P=0.036)；碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌感染的独立危险因素为分离菌株前使用碳青霉烯类药物(P=0.003)、气管切开(P=0.014)和前期住院史(P=0.029)。