论文部分内容阅读
代谢型谷氨酸受体（Metabotropic glutamate receptors mGluR）作为谷氨酸受体家族的一员,是一种重要的神经递质受体,主要存在于哺乳动物神经细胞中,该受体是G蛋白偶联受体（G protein coupled receptor GPCRs）C家族成员,根据该受体蛋白序列同源性、偶联的第二信使、以及激动剂特异性,将该受体分为3类:Ⅰ型mGluRs包括mGluR1和mGluR5;Ⅱ型mGluRs包括mGluR2和mGluR3;Ⅲ型mGluRs包括mGluR4、mGluR6-8。通常,该受体参与各种生理病理活动是通过与受体的天然配体谷氨酸（Glutamate）结合,引发受体构象上的变化,致使受体处于激活状态,进而激活受体偶联的G蛋白,触发下游信号来进行的。受体激活的结果主要是调节突触传递,调节神经元的兴奋性。受体的亚型的多样性、发挥生理功能的方式特点使其与机体多种生理过程比如:学习、记忆、认知等有着紧密的关联,同时该受体还广泛参与多种神经退行性疾病,这也使得科研工作者对该受体的研究热情持续不退。代谢型谷氨酸受体在体内受到调控是牵一发而动全身的,这种调控是极其精细的,任何有别于正常水平的的激活或者抑制,均会导致多种神经、精神性疾病的发生。此外,该受体还与癌症的发生、肿瘤的恶性增殖等还有着密切的关系,参与了与癌症相关的多种信号通路。研究发现,抑制胞内L谷氨酸（Glutamate）的释放,通过竞争性或者非竞争性的拮抗剂抑制受体激活可以降低细胞增殖、迁移、侵袭的能力,诱导肿瘤细胞比如乳腺癌、黑色素瘤、神经胶质瘤等细胞的凋亡。综上所述,代谢型谷氨酸受体和L-谷氨酸起始的一些信号通路已经成为治疗神经退行性疾病和肿瘤的非常具有潜力的药物靶点。目前,以mGluR2为药物靶点的药物研发工作已经取得了比较大的进步,所研发的多种药物也已经用于临床,只是不足之处在于,以mGluR2为靶点研发出的一些药物临床应用过程中出现了药物依赖、特异性有限等副作用。因此,构建以mGluR2为靶点的稳定细胞系模型,将其用于药物筛选和研发,有利于科研工作者对mGluR2的研究,同时也可以提高以mGluR2为靶点的药物筛选与研发进度。本研究选取mGluR2受体为药物靶点,构建基于该靶点的细胞系的药物筛选模型。将本实验室构建的质粒pOG44、pcDNA5/FRT-Flag-CLIP-mGluR2-GB2-C-KKTN和pEGFP-N1-HA-SNAP-mGluR2-GB1-C-KKTN共转进Flp-in CHO细胞系中,先用相对应的抗生素筛选出可能的单克隆,然后进行Ca2+信号检测的方法,得到了mGluR2受体稳定表达细胞系。然后分别使用代谢型谷氨酸受体的天然配体谷氨酸（Glutamate）和激动剂LY379268、对细胞株进行了功能检测以及稳定性检测等,最终获得了mGluR2稳定表达细胞株。本研究中,pOG44是一种可以协助外源质粒整合到宿主细胞基因组,帮助外源基因随宿主细胞稳定表达的质粒,而SNAP和CLIP标签可以赋予该细胞模型一种新的、有特色的药物筛选的手段,即时间分辨荧光共振能量转移技术（TR-TRFT）。在细胞系构建过程中,我们将pOG44、和带有SNAP标签的质粒pEGFP-N1-HA-SNAP-mGluR2-GB1-C-KKTN和带有CLIP标签的质粒pcDNA5/FRT-Flag-Clip-mGluR2-GB2-C-KKTN共转进Flp-in CHO细胞中,利用G418和HygromycinB筛选、酶连免疫吸附技术（ELISA）和第二信使(Ca2+)信号检测等实验技术,挑选出一些既能上膜表达又能激活下游Ca2+信号的克隆细胞株,最终构建成基于mGluR2受体这个靶点的的高通量药物筛选细胞系模型。本文建立的以mGluR2受体为靶点的高通量稳定药物筛选模型,这种细胞系模型具有的优势是可筛选小分子活性化合物,可以利用特异性更高,稳定性更好,无放射性的新型技术手段,大大提高了神经性退行性疾病药物的开发效率。