目的：　　肝纤维化是由多种病因导致慢性肝病共有的病理改变，特征性地表现为肝内细胞外基质(extracellu larmatrix，ECM)的过度合成与沉积。有多项研究证实，肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)是肝纤维化形成过程中的关键细胞成分，是肝内ECM的主要细胞来源。目前认为抑制HSCs活化与增殖是阻止并逆转肝纤维化的主要途径之一。　　近年来研究发现，Raf-1/MEK/ERK1，2信号通路参与了HSCs活化与增殖的调控过程，与肝纤维化的发生发展关系密切，可从多方面影响肝纤维化的形成。而Raf激酶抑制蛋白(RKIP)是该信号通路的抑制因子，是否意味着RKIP在肝纤维化中具有重要的调控作用？引起了我们极大兴趣和深入研究。　　本实验采用免疫性肝纤维化动物模型和体外细胞模型，研究Raf激酶抑制蛋白(RKIP)在肝纤维化不同时期肝组织中的分布及含量变化，以及信号通路蛋白ERK的活化情况，探讨肝纤维化进程中Raf-1/MEK/ERK1，2信号通路的激活与RKIP的表达和磷酸化水平的相关性;同时，利用IL-1β激活HSCs细胞，检测细胞活化情况，以及RKIP、ERK1/2、p-ERK1/2和胶原的表达水平，了解RKIP对HSCs增殖、凋亡的影响。本研究将初步阐明RKIP在肝纤维化发生机制中的调控作用。　　方法：　　第一部分 动物实验　　SD雄性大鼠88只，模型组(60只)用无菌猪血清腹腔注射0.5mL/只，每周2次，共18周，复制大鼠肝纤维化模型;正常对照组(28只)腹腔注射生理盐水0.5mL/只，每周两次。各组分别于第8wk、11wk、14wk、18wk随机选取正常对照组7只，模型组15只，眼球取血后立即处死，留取左叶肝组织于-80℃保存，再切取部分肝脏左叶以4％多聚甲醛固定，以备后用。采用全自动生化分析仪检测血清ALT、AST水平，ELISA试剂盒法检测血清Ⅰ型胶原(COL-Ⅰ)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)含量;ELISA试剂盒法检测肝组织Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、层粘连蛋白(LN)含量;HE染色、Masson三色染色检测肝纤维化发展情况;免疫组织化学检测肝组织RKIP、p-RKIP、p-ERK1/2、ERK1/2表达情况;RT-PCR法检测肝组织RKIP mRNA、COL-ⅠmRNA、COL-ⅢmRNA、ERK1mRNA、ERK2mRNA的表达量;Western blot方法检测肝组织RKIP、p-RKIP、p-ERK1/2、ERK1/2、Raf、p-Raf、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、MEK、p-MEK和α-SMA的蛋白表达水平。　　第二部分 细胞实验　　采用密度梯度离心法提取分离大鼠原代肝星状细胞(HSCs)并采用免疫细胞化学染色法检测细胞活化情况。细胞被IL-1β和Locostatin(RKIP阻断剂)处理后，采用MTT法检测HSCs的增殖;RT-PCR法检测RKIPmRNA、ERK1mRNA、COL-ⅠmRNA、COL-ⅢmRNA的表达量，Western blot方法检测RKIP、ERK1/2、p-ERK1/2、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ和a-SMA的蛋白表达水平。　　结果：　　1.成功复制免疫性肝纤维化动物模型　　血清学实验结果表明，与正常组比较，模型组中ALT、AST值随造模时间的延长出现先升高后下降的趋势;血清HA、LN、COL-Ⅰ、PCⅢ的含量均高于正常组大鼠;HE染色和Masson染色结果表明，模型组肝细胞可见慢性炎细胞浸润，肝索排列紊乱，汇管区和中央静脉结缔组织变厚，肝组织胶原纤维明显增多;RT-PCR检测结果显示，COL-ⅠmRNA、COL-ⅠmRNA的表达量高于正常组;Western blot检测结果显示，COL-Ⅰ、COL-Ⅲ的表达量随造模时间的延长而升高（p＜0.05或p＜0.01）。以上检测结果说明该模型符合免疫性肝纤维化的病理改变特征，表明造模是成功的，且随造模时间的延长肝纤维化程度是加重的。　　2.Raf-1/MEK/ERK1，2信号通路在肝纤维化中的表达情况　　免疫组织化学法检测结果显示，正常组大鼠肝组织中ERK及p-ERK表达很少，而模型组大鼠肝组织中ERK及p-ERK的表达量较高，且随着造模时间的延长，ERK及p-ERK的表达量呈递增趋势;RT-PCR检测结果表明，ERK1mRNA和ERK2mRNA的表达随造模时间延长呈上升趋势;Western blot检测发现，ERK在正常肝组织中表达量较少，模型组中ERK表达量增多;p-ERK在正常组大鼠肝组织中表达量较少，随造模时间的延长，模型组中p-ERK的表达量先升高后出现下降的趋势;随造模时间的延长，Raf的表达量呈下降趋势，而p-Raf呈上升趋势;MEK在正常组的表达量较高，随造模时间的延长出现下降的趋势，p-MEK的表达量则呈上升趋势（p＜0.05或p＜0.01）。以上结果表明，随着肝纤维化程度的加重，Raf-1/MEK/ERK1，2信号通路被激活，Raf-1、MEK、ERK1，2均发生显著性变化，同时其磷酸化水平升高，提示肝纤维化的发生发展与Rat-1/MEK/ERK1，2信号通路的激活密切相关。　　3.RKIP在肝纤维化中的表达情况　　免疫组织化学法检测结果显示，正常组大鼠肝组织中RKIP表达量较高，模型组大鼠肝脏中RKIP阳性细胞明显减少;正常大鼠肝组织的p-RKIP表达量较低，随造模时间延长，模型组大鼠肝脏中p-RKIP表达增强;RT-PCR检测结果显示，模型组大鼠肝组织中RKIP mRNA表达随造模时间的延长出现降低的趋势;同时，Western blot检测结果显示，RKIP在正常组大鼠肝组织中表达量较高，模型组大鼠肝组织中RKIP表达量降低(p＜0.05或p＜0.01）。　　结合前述实验结果及本次实验数据，提示RKIP表达量的下降可能与Raf-1/MEK/ERK1，2信号通路的激活密切相关。　　4.体外HSCs实验结果　　细胞MTT结果显示，与正常组比较，IL-1β刺激组的细胞增殖率为80.2％，Locostatin+IL-1β组的细胞增殖率为25.1％，Locostatin组的细胞增殖率为7.7％。RT-PCR法检测结果显示，与正常组比较，IL-1β刺激组、Locostatin+IL-1β组及Locostatin组的大鼠HSCs的RKIP mRNA的表达量无统计学差异，而ERK1mRNA、COL-ⅠmRNA、COL-ⅢmRNA表达量显著升高。Western blot检测结果显示，与正常组比较，经IL-1β作用48h的HSCs的RKIP、ERK、p-ERK及COL-Ⅰ、COL-Ⅲ的蛋白表达量均显著升高，经Locostatin作用48h的HSCs的RKIP、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ蛋白表达量显著下降，而p-ERK、a-SMA的蛋白表达量显著升高，经Locostatin作用1h后经IL-1β作用47h的HSCs的RKIP的蛋白表达量显著下降，而p-ERK的蛋白表达量显著升高(p＜0.05或p＜0.01)。以上结果提示，RKIP经Locostatin抑制后表达量下降，Raf-1/MEK/ERK1，2信号转导通路被激活促进了HSCs的活化、增殖。　　结论：　　我们的实验表明，肝纤维化过程中Raf-1/MEK/ERK1，2信号转导途径的激活与RKIP的蛋白表达下降和磷酸化增加密切相关，RKIP在肝纤维化发生机制中具有重要的调控作用。因此，通过RKIP超表达从而抑制Raf-1/MEK/ERK1，2信号转导通路，可能是研究治疗肝纤维化新药的重要方向。