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免疫治疗已成为继手术、放疗、化疗之后的一种新的肿瘤治疗模式。其中,肿瘤疫苗的主动性免疫是免疫治疗的重要方法之一,近年来,国内外都加强了肿瘤疫苗的研制,但进展较缓慢,主要原因在于疫苗进入患者体内难以有效激活抗原特异性T细胞,如何解决这一问题成为肿瘤疫苗研制的难点。肿瘤治疗性疫苗进入患者体内后有效激活抗原特异性T细胞需要被抗原递呈细胞(antigenpresenting cell,APC)有效呈递。树突状细胞(dendritic cell,DC)是目前功能最强的APC,可以摄取、加工处理外源性抗原并以抗原多肽-主要组织相容性复合体 Ⅱ(major histocompatibility complex Ⅱ,MHC Ⅱ)分子复合物的形式呈递给CD4+T细胞,激活Th1、Th2效应性T细胞,从而产生免疫应答。此外,DC也可以将抗原多肽-MHC Ⅰ类分子复合物呈递给CD8+T细胞,激活细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicity T lymphocyte,CTL)介导的免疫应答,从而发挥清除病原菌、杀灭肿瘤的作用。体外通过IFN-α联合GM-CSF诱导人外周血单核细胞分化产生的干扰素-树突状细胞(IFN-DC)和IL-4联合GM-CSF诱导产生的白介素4-树突状细胞(IL-4-DC)是免疫治疗常用的方法,但是,其形态、功能尚需进一步比较以明确哪种DC用于免疫治疗更为有效。富含短寿蛋白的自噬小体(DRipsinblebs,简称DRibbles)是包含多种肿瘤细胞抗原的囊泡,其主要成分为自噬小体。既往研究发现DRibbles能够在小鼠体内高效的交叉激活肿瘤抗原特异性CTL,并能在体外激活人病毒抗原特异性CTL。DRibbles是否能够在人体内激活抗原特异性T细胞尚未可知。本研究通过体外诱导单核细胞生成了 IFN-DC和IL-4-DC,比较了两种DC的形态、表型、功能,选取交叉递呈功能更强的IFN-DC作为APC,将其与肝癌细胞来源的DRibbles联合注射入肝癌患者体内,并检测患者体内抗原特异性T细胞的激活。本研究的开展有助于研发基于DC及DRibbles的肿瘤免疫治疗方案。目的:1.通过体外培养IFN-DC和IL-4-DC,研究两种细胞在形态学、表型、分泌细胞因子及交叉递呈功能上的区别,为DC疫苗用于肿瘤患者的免疫治疗奠定基础。2.初步研究IFN-DC联合肝癌疫苗在肝癌患者体内激活抗原特异性T细胞应答的作用。方法:1.在体外分别用细胞因子GM-CSF联合IFN-α或者GM-CSF联合IL-4诱导培养人外周血单核细胞为IFN-DC或IL-4-DC,随后加入TNF-α促进DC成熟,通过光镜和电镜观察两种DC的形态,流式细胞术检测两种DC的表型,ELISA法测定两种DC分泌的细胞因子含量(IL-1β、IL-10、IL-12p70、IL-18、IL-23);随后将两种DC分别负载CMVpp65蛋白后与自体T淋巴细胞共培养,通过细胞内染色方法检测T细胞分泌IFN-γ的情况。2.入组6例原发性肝癌患者。方法同上获取患者PBMC及培养IFN-DC,将IFN-DC皮下注射,同时在彩超引导下行双侧腹股沟淋巴结注射SMMC7721-DRibbles;1月后,IFN-DC体外负载SMMC7721-DRibbles,在患者双侧腹股沟淋巴结区域皮下注射。采集患者治疗前及治疗后的PBMC,通过流式细胞术检测患者PBMC中T细胞亚群比例、ELISPOT及胞内染色方法检测患者PBMC中抗原特异性T细胞比例。结果:1.IFN-DC和IL-4-DC均具有典型的树突状细胞形态,成熟的IFN-DC的突起较短且粗,而成熟的IL-4-DC的突起较长且细;同时成熟的IFN-DC比成熟的IL-4-DC含有更多的细胞器,而成熟的IL-4-DC包含更多的细胞空泡。2.单核细胞低表达HLA-DR、CD11c、CD80、CD83、CD86,未成熟DC中度表达 CD80、CD83、CD86,成熟型 DC 表达 HLA-DR、CD80、CD86 及 CD83均上调;与IL-4-DC相比,IFN-DC表达更高水平的CD80、CD83、CD86,HLA-DR的表达水平类似,成熟IFN-DC表达CD11c的水平低于成熟IL-4-DC。3.两种DC未成熟状态下分泌少量的细胞因子(IL-10、IL-1β、IL-18、IL-12p70、IL-23),促成熟后,两种DC均能分泌大量细胞因子;成熟的IFN-DC分泌的细胞因子IL-10、IL-1β、IL-18、IL-12p70 高于成熟的 IL-4-DC,IL-23 相差不明显。4.负载CMVpp65蛋白的不成熟IFN-DC及不成熟IL-4-DC能够分别诱导(0.28±0.07)%及(0.12±0.02)%的自体 CD8+T 细胞激活(P<0.05);成熟 IFN-DC及成熟IL-4-DC能够分别激活(1.03±0.21)%及(0.35±0.14)%的自体CD8+T细胞(P<0.05)。5.IFN-DC联合SMMC7721-DRibbles治疗较安全,无严重不良反应。6.与治疗前相比,IFN-DC联合SMMC7721-DRibbles治疗后患者CD3+ T细胞占 PBMC 的比例无明显变化(60.5±9.9%VS60.5±7.9%,P>0.05),CD3+CD4+ T 细胞占 CD3+ T 细胞的比例下降(58.9±7.1%VS 53.3±2.6%,P<0.05),CD3+ CD8+ T 细胞占 CD3+ T 细胞的比例上升(28.7±5.9%VS 35.7+5.6%,P<0.05),CD3+CD56+NKT 细胞比例无明显变化(5.6±2.6%VS6.1±3.3%,P>0.05)。7.IFN-DC联合SMMC7721-DRibbles治疗能够诱导原发性肝癌患者体内肝癌抗原特异性T细胞激活。结论:1.IFN-DC和IL-4-DC在形态、表型和功能上均有不同。与IL-4-DC相比,IFN-DC能够表达更高水平的CD80、CD83、CD86,分泌更多的细胞因子,负载CMVpp65蛋白能够更有效激活人抗原特异性CD8+ T细胞。因此,IFN-DC用于肿瘤的免疫治疗可能比IL-4-DC更有效。2.IFN-DC联合SMMC7721-DRibbles治疗肝癌患者安全,能够诱导患者体内抗原特异性T细胞的激活。