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研究背景及目的:上皮性卵巢癌（Epithelial ovarian cancer,EOC）作为卵巢癌（Ovarian cancer,OC）中最主要的亚型,具有侵袭性强、预后差等特点,是妇科肿瘤死亡的最常见原因。卵巢癌的发生和发展与Hedgehog（Hh）信号通路的异常激活密切相关,约14%的卵巢癌患者出现Hh信号通路成员的体细胞改变。因此,药物抑制Hh信号通路已成为一种有前景的抗肿瘤途径。雷公藤内酯醇（Triptolide,TPL）因其具有抑制多种肿瘤生长的潜力而备受关注,但其参与抗肿瘤的作用机制有待于进一步挖掘。本研究旨在探索TPL是否可以通过调控Hh信号通路活性来影响EOC的增殖、迁移及侵袭行为,从而为TPL作为抗EOC药物的研发提供新的分子基础。研究方法与结果:第一章:雷公藤内酯醇通过抑制Hh信号通路活性抑制卵巢癌细胞增殖、迁移及侵袭研究方法:1)采用CCK8法检测TPL在作用不同浓度及不同时间后对上皮性卵巢癌细胞SKOV3和A2780的毒性影响。利用EdU增殖实验检测TPL对SKOV3和A2780增殖能力影响。采用划痕实验、Transwell迁移及Transwell侵袭实验检测TPL对SKOV3和A2780迁移及侵袭能力影响;2)采用Western blot检测TPL给药后对上皮性卵巢癌细胞中的Hh信号通路靶基因Ptch1、Gli1及Bcl-2蛋白表达水平的影响。采用双荧光素酶实验检测TPL对Hh信号通路活性的影响;3)采用CCK8和EdU增殖实验检测TPL对经Smo激动剂SAG进一步激活Hh信号通路活性的SKOV3和A2780细胞增殖能力的影响。采用划痕实验、Transwell迁移及Transwell侵袭实验检测TPL对经SAG进一步激活Hh信号通路活性的SKOV3和A2780细胞迁移及侵袭能力的影响。采用Western blot实验检测TPL对经SAG进一步激活Hh信号通路活性的SKOV3和A2780细胞中的N-cadherin,E-cadherin及MMP9蛋白表达水平的影响;研究结果:（1）雷公藤内酯醇抑制SKOV3及A2780细胞的增殖、迁移及侵袭能力TPL对上皮性卵巢癌细胞SKOV3及A2780具有明显的毒性作用,且呈现出时间和剂量依赖性。TPL以浓度依赖的方式显著抑制SKOV3及A2780细胞的体外增殖、迁移及侵袭能力。（2）雷公藤内酯醇下调上皮性卵巢癌细胞中Hh信号通路活性TPL以浓度及时间依赖的方式下调SKOV3及A2780细胞中Hh信号通路靶基因Ptch1、Gli1及Bcl-2的蛋白表达水平。TPL在HEK293T及NIH3T3细胞中均可显著抑制Hh信号通路活性。（3）雷公藤内酯醇通过抑制Hh信号通路活性抑制卵巢癌细胞增殖、迁移及侵袭能力Smo激动剂SAG能有效促进SKOV3和A2780细胞的增殖、迁移及侵袭,而TPL给药后则以浓度依赖的方式显著逆转SAG诱导的细胞增殖、迁移及侵袭能力。SAG可明显上调N-cadherin和MMP9的蛋白表达水平,下调E-cadherin的蛋白表达水平,而TPL以浓度依赖的方式显著逆转这结果。第二章:雷公藤内酯醇抑制Hh信号通路活性的分子机制及体内抗肿瘤作用研究方法:1)采用BODIPY-cyclopamine竞争结合实验探索TPL是否通过靶向作用Smo来影响Hh信号通路活性。通过构建耐Smo抑制剂GDC0449的耐药突变质粒Smo D473H,利用Western blot实验检测TPL是否可以克服因Smo D473H产生的耐药。2)采用RT-PCR和Western blot探索TPL对过表达Gli1和Gli2的HEK293T细胞中Hh信号通路靶基因Ptch1和Bcl-2蛋白水平的影响。采用细胞内热稳定实验（Cellular Thermal Shift Assay,CETSA）探索TPL的作用靶点。3)采用免疫荧光检测TPL对转录因子Gli1和Gli2细胞核和细胞质蛋白表达水平的影响。采用Western blot检测TPL对Gli1和Gli2蛋白稳定性的影响。4)构建上皮性卵巢癌细胞A2780裸鼠皮下移植瘤模型,检测TPL对卵巢移植瘤小鼠体重及皮下移植瘤瘤体体积和重量的影响。采用H＆E染色检测TPL对小鼠重要脏器心、肝、肾的影响。采用IHC检测雷公藤内酯醇对移植瘤Ki-67、增殖细胞核抗原（Pcna）、Gli1和Gli2蛋白表达水平的影响。研究结果:（1）雷公藤内酯醇可以克服Smo D473H突变引起的耐药BODIPY-cyclopamine竞争结合实验的荧光定性实验及流式分析定量实验结果表明TPL不能同环靶明（cyclopamine）一样与BODIPY-cyclopamine竞争Smo的结合位点。较野生型Smo(Smo WT)相比,Smo突变质粒Smo D473H表现出明显的GDC0449耐药性,并且TPL能以浓度依赖的方式有效的克服Smo D473H引起的耐药。（2）雷公藤内酯醇通过靶向作用Gli来抑制Hh信号通路活性TPL可下调过表达Gli1和Gli2后的HEK293T细胞中Hh信号通路靶基因Ptch1和Bcl-2的m RNA及蛋白表达水平,并且,TPL被证实可以显著提高Gli1和Gli2蛋白热稳定性。（3）雷公藤内酯醇通过蛋白酶体降解途径降低Gli1和Gli2蛋白稳定性TPL对Hh信号通路的影响并非通过影响转录因子Gli1和Gli2的核定位。相较于单独使用蛋白合成抑制剂放线菌酮（CHX）,联合使用TPL可显著加快转录因子Gli1及Gli2的蛋白质降解速率,研究进一步证实蛋白酶体抑制剂MG132干预后可显著逆转被TPL下调的Gli1和Gli2蛋白表达水平。（4）雷公藤内酯醇体内抑制A2780荷瘤裸鼠皮下移植瘤的生长将上皮卵巢癌细胞A2780接种于裸鼠右侧腹股沟处皮下,成功构建A2780皮下移植瘤模型。予雷公藤内酯醇（0.2mg/kg/d及0.4mg/kg/d）腹腔给药后可明显降低A2780荷瘤裸鼠皮下移植瘤的生长,并显著降低瘤体的重量,且对裸鼠的体重及一般状况没有显著的影响。并且,TPL在此次给药剂量及给药时间下对裸鼠心脏、肝脏、肾脏没有明显的毒副作用。TPL可显著下调Ki-67、Pcna、Gli1和Gli2的阳性细胞表达水平。研究结论:1.雷公藤内酯醇以浓度及时间依赖的方式下调上皮性卵巢癌中的Hh信号通路活性;2.雷公藤内酯醇通过抑制Hh信号通路活性抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力及影响EMT过程;3.雷公藤内酯醇可以克服Smo D473H突变引起的耐药,并且可以通过蛋白酶体降解途径来促进Gli1和Gli2蛋白降解进而降低Hh信号通路活性;4.雷公藤内酯醇显著抑制卵巢癌细胞A2780裸鼠皮下移植瘤的生长及Hh信号通路活性;