DNA疫苗具有诱导体液和细胞免疫的双重效应，将最有希望成为预防和治疗艾滋病、疟疾等疾病的候选疫苗，这一领域的快速发展也极大地增加了对药用质粒DNA的需求量。然而无论在产量还是纯度上，目前实验室小量制备质粒DNA的方法都不能满足药用质粒DNA大规模制备的需求。获取合适的质粒DNA制备工艺已成为DNA疫苗领域快速发展的瓶颈。本实验室构建的疟疾DNA疫苗经小鼠及恒河猴试验表明具有很好的免疫原性，为申请临床试验，特进行了制备工艺的研究。发酵是质粒生产的第一步，影响发酵时质粒产量的主要因素包括菌株、重组质粒和培养环境。为了提高发酵培养时工程菌质粒的稳定性，本研究首先构建了带卡那霉素抗性标签的工程菌pCD-Awte／DH5α。接着优化了工程菌的发酵条件，分别在摇瓶和5L发酵罐水平考察基本培养基组成及来源、补料培养基组分和温度转换对工程菌生长及质粒产量的影响。结果表明在TB培养基组分中添加Mg²⁺、微量元素复合物、核苷等养分，补料培养基由葡萄糖代替甘油，对数中期温度由37℃升至42℃能提高质粒的产量。在优化的培养条件下质粒产量能达122-130mg／L培养液。本研究采用碱裂解法从发酵菌体中粗提取质粒DNA。通过分级浓缩后，采用一套色谱纯化工艺来去除粗提液中混有的宿主RNA、蛋白质、基因组DNA、内毒素、超螺旋质粒DNA的变性体等杂质，以期获得质粒纯品。这套工艺包括Sepharose 6FF分子筛层析、Plasmidselect亲硫吸附层析和Source 30Q离子交换层析、G25分子筛层析四步。接着对纯品中混有的杂质进行质量分析，其中宿主RNA和超螺质粒DNA的变性体采用琼脂糖凝胶电泳法、蛋白质采用ELISA法、基因组DNA采用荧光定量PCR法、内毒素采用鲎试剂法来检测。结果表明纯品质量符合Ferreira等推荐的药用标准。