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表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG,(-)-epigallocatechin gallate)是绿茶儿茶素中具有多酚羟基结构的重要活性单体。其在多种疾病的预防和治疗中展现出具大的功能潜力,如心血管健康保护领域。研究表明EGCG对心血管疾病的保护作用与其强有力的抗氧化活性密切相关。然而,EGCG的多羟基结构,限制了其在食品、化妆品和药品等领域的应用。在儿茶素的活性部位引入新基团对其进行局部改造,能够增加其在油脂中的溶解性、稳定性,提高生物利用度及扩展活性等。EGCG的结构修饰研究较多,然而以功能性多不饱和脂肪酸的生物活性作为定向设计衍生脂溶性儿茶素的分子修饰研究却鲜少被报道。本研究用儿茶素EGCG和长链脂肪酸DHA(C22:6n-3),在脂肪酶的催化下进行定向分子结构修饰,生成新衍生物质C22-EGCG,并对不同生物酶的酶法合成体系进行探讨。探究了不同底物配比、不同反应溶剂体系、不同反应时间对产物C22-EGCG衍生活性物质产率的影响,用HPLC和UPLC-MS等方法对衍生新物质C22-EGCG进行分子结构分析,并对衍生新物质C22-EGCG的抗氧化能力进行比较研究。酶法催化C22-EGCG合成的单因素实验中,Novozyme435催化C22-EGCG转化的效果比Lipase A好,因此选择Novozyme435作为最适催化剂。当EGCG/DHA摩尔比为1:4时,Novozyme435催化C22-EGCG的转化率达到最高值83.36%,且与1:3有显著性差异,考虑DHA/EGCG=1:4作为最佳的底物配比。当体系溶剂为乙腈,Novozyme435催化C22-EGCG转化率达到最高值79.75%,且与甲醇、水都存在显著性差异,综合考虑选择乙腈为最佳反应溶剂。随着反应时间的增加,C22-EGCG的转化率逐渐增加,当反应时间为12h时,Novozyme435催化C22-EGCG转化率达到最高值94.05%。且与4h有显著性差异,但与8h无显著性差异,考虑8h作为最佳反应时间。综上,酶法合成体系最佳反应条件:以脂肪酶novozyme435作为催化剂,EGCG/DHA摩尔比为1:4、反应溶剂为乙腈、反应时间为8h。HPLC对衍生活性物质C22-EGCG进行色谱技术分离的实验结果表明,在λ=280 nm时可以观察到EGCG出峰时间在15.108 min。在λ=195 nm时,观察到DHA的出峰时间为34.615 min。C22-EGCG为单一峰,出峰时间在36.968 min,能与DHA完全分离开来。选择260-300 nm的范围,可以观察到EGCG的特征光谱,EGCG在274 nm处具有最高的吸收峰。选择190-210 nm的范围,可以观察到DHA和C22-EGCG的特征光谱,DHA和C22-EGCG有一样的特征光谱,且都在196 nm处具有最高的吸收峰。UPLC-MS对衍生活性物质C22-EGCG进行结构分析实验中,结合MS scan、daughter模式和MRM模式可以得到EGCG的三个子片段,荷质比分别为m/z=169、m/z=305、m/z=457。DHA的5个子片段,荷质比分别为m/z=59、m/z=135、m/z=152、m/z=283、m/z=327。对所合成并分离纯化的样品进行结构解析,发现高频m/z=293、m/z=355、m/z=381、m/z=518、m/z=653、m/z=727一直存在,并且由EGCG和DHA的片段组合而成。解析结果验证了C22-EGCG的主体结构,为其准确的分子构型分析提供了依据。抗氧化实验中,DPPH体系以乙醇作空白对照,VC作阳性对照。结果表明C22-EGCG和VC、EGCG一样具有较强的清除DPPH·自由基的能力,DHA也具有一定的清除DPPH·自由基的能力。且清除DPPH·自由基的能力为:C22-EGCG>EGCG>VC>DHA。此时C22-EGCG的DPPH·自由基清除率达到87.84%,显著高于EGCG和VC。ABTS体系以水作空白对照,VC作阳性对照。结果表明C22-EGCG和VC、EGCG一样具有较强的清除ABTS·自由基的能力,DHA基本不具有清除ABTS·自由基的能力。且清除ABTS·的能力为:C22-EGCG>EGCG>VC。此时C22-EGCG的ABTS·自由基清除率达到92.63%,显著高于EGCG和VC。本研究中DHA的引入使酶法衍生产物C22-EGCG的抗氧化活性增强。