目的：1.通过培养乳鼠原代心肌细胞建立缺血缺氧模型,观察心肌细胞在缺血缺氧环境细胞损伤、凋亡与能量代谢变化情况。2.观察益气活血中药人参及毛冬青的主要有效成分人参皂苷Rb1(GS Rb1)及毛冬青甲素(IA)对缺血缺氧心肌细胞损伤及凋亡的影响,探讨GS Rb1与IA对缺血缺氧心肌细胞的保护作用。3.初步探索缺血缺氧心肌细胞中能量代谢AMPK-PGC-1a通路表达及腺苷酸生成情况,初步探讨人参皂苷Rb1(GS Rbl)与毛冬青甲素(IA)干预缺血缺氧心肌细胞的能量代谢途径,了解其对缺血缺氧心肌细胞的保护作用机制,为益气活血法用于心力衰竭的防治提供理论依据。方法：1.原代心肌细胞缺血缺氧模型的建立：选取新生SD乳鼠采集心肌组织消化成心肌细胞的单细胞悬液,正常培养72h后利用缺血培养液及物理缺氧方法分别对心肌细胞进行缺血缺氧30min、1h、2h、3h、 4h、6h、12h、24h造模干预。通过氧气含量指示剂确认缺氧水平,利用CCK8法检测细胞活力,光镜、电镜观察细胞损伤情况,建立缺血缺氧心肌细胞模型。2.GS Rbl与IA对缺血缺氧心肌细胞及线粒体的保护作用研究：正常培养乳鼠心肌细胞48h后将细胞分为11组：正常组、模型组、曲美他嗪组、参高组、参低组、毛高组、毛低组、参高毛高组、参高毛低组、参低毛高组、参低毛低组。正常组与模型组继续完全培养液正常放置培养箱内培养,给药组分别置换添加相应浓度药液的培养液继续培养24h,共培养72h。利用缺血缺氧造模方法对模型组及各给药组进行缺血缺氧造模干预6h,正常组继续正常培养6h。78h收集细胞进行检测。利用CCK8检测细胞活力、比色法检测LDH、FFA、MDA水平、倒置显微镜、电镜观察细胞损伤情况、TUNEL法检测细胞凋亡率、流式细胞仪检测mPTP开放情况。3.GS Rbl与IA干预缺血缺氧心肌细胞能量代谢的机制研究：首先探讨心肌细胞在缺血缺氧环境中能量代谢相关代谢变化情况。将细胞分为2组：正常组、模型组。利用前述实验方法对乳鼠心肌细胞进行培养造模及药物干预,利用western blot检测能量底物代谢相关蛋白AMPK、PGC-1a、PPARa、GLUT4、CPT-1、 ACADM和线粒体生成相关蛋白Tfam、NRF2蛋白表达水平。探究人参皂苷Rbl与毛冬青甲素干预后缺血缺氧心肌细胞上述能量代谢相关蛋白的表达情况,探讨两药干预缺血缺氧心肌细胞能量代谢的相关机制。将细胞分为10组,分别为模型组、曲美他嗪组、参高组、参低组、毛高组、毛低组、参高毛高组、参高毛低组、参低毛高组、参低毛低组。利用westernblot检测上述能量代谢相关蛋白表达情况。高效液相色谱法检测腺苷酸AMP、ADP、ATP含量。结果：1.原代心肌细胞缺血缺氧模型的建立：通过氧气含量指示剂确认在缺氧盒内心肌细胞达到缺氧要求。通过CCK8检测细胞活性曲线和光镜、电镜观察心肌细胞在缺血缺氧环境中各个时间节点形态学的改变,选取6h为缺氧造模时间点。模型组与正常组心肌细胞比较具有明显细胞损伤的形态学改变,搏动力显著下降,细胞活力明显降低,出现明显的衰竭心肌细胞表现,缺血缺氧心肌细胞造模成立。2. GS Rbl与IA对缺血缺氧心肌细胞及线粒体的保护作用研究：2.1.光镜观察：将心肌细胞进行分组给药后,倒置显微镜下可观察到缺血缺氧模型组心肌细胞出现明显细胞损伤表现,心肌搏动力明显下降,搏动频率减慢。曲美他嗪组较模型组心肌细胞活力明显增强,细胞形态未受明显影响,细胞搏动力与频率较正常组稍减,较模型组明显好转。人参皂苷Rbl与毛冬青甲素给药组细胞形态与搏动力均较模型组有改善,以人参皂苷Rbl高剂量与毛冬青甲素高剂量联用组心肌细胞保护作用最显著,两药剂量与细胞保护效力呈量效关系。2.2.电镜观察：通过电镜下分析各分组给药心肌细胞形态与各细胞器、线粒体形态,人参皂苷Rbl与毛冬青甲素干预组与曲美他嗪组细胞损伤程度较模型组均有不同程度改善,线粒体功能与完整性得到保护,并发现人参皂苷Rbl与毛冬青甲素高剂量联用组抗缺血缺氧损伤效用与曲美他嗪作用相似,同时电镜分析说明人参皂苷Rbl与毛冬青甲素在单药与联用对缺血缺氧心肌细胞的保护作用均存在量效关系,人参皂苷Rbl高剂量与毛冬青甲素高剂量单药作用相似。2.3.细胞活力检测：通过CCK8法检测细胞存活率显示,模型组与正常组相比细胞存活率明显减低。模型组与药物干预组对比,各给药干预组细胞存活率均有一定程度提高,两药联用组较单药组有更高效用,参高毛高组具有最明显作用,显著地改善了缺血缺氧心肌细胞的细胞损伤。2.4.细胞损伤相关指标：LDH、FFA、MDA检测显示：模型组与空白组对比LDH、FFA、MDA均明显上升,缺血缺氧后细胞损伤模型建成。各给药干预组与模型组对比,LDH、FFA、MDA含量均明显降低。各给药干预组对减低细胞内LDH、FFA、MDA均有一定作用,作用分别呈量效关系。人参皂苷Rbl高低剂量均能够明显降低LDH含量,且呈量效关系。毛冬青甲素高剂量可降低LDH含量。两药联用组能够明显降低LDH,且作用较人参皂苷Rbl与毛冬青甲素单药明显,呈量效关系,参高毛高组具有最优效用。参高毛高组在降低胞内FFA有最优效用(P<0.01)。在给药干预组与模型组的对比中,各个给药组MDA含量与模型组有非常大的差异,P<0.01,有统计学意义,说明各个给药组都对缺血缺氧心肌细胞氧化损伤有治疗作用。在曲美他嗪组分别与参高组、参低组、参高毛高组、参低毛低组、参低毛高组的两两比较中无统计学差异。说明这5组对MDA指示的细胞过氧化损伤与曲美他嗪治疗效应相似。2.5. MPTP开放检测：利用钙黄绿素-AM (Calcein-AM)对细胞质、线粒体进行染色,再通过氯化钻与细胞质内钙黄绿素发生反应荧光猝灭,分析得线粒体通透性转移孔mPTP开放情况,从而得到在造模干预情况下细胞线粒体功能状态。模型组荧光表达较正常组相比明显下降,曲美他嗪组与参高毛高组比较相近,说明两者在抑制线粒体通透性转移孔开放方面具有相近效用。人参皂苷Rb1与毛冬青甲素对抑制mPTP开放调控的作用均呈量效关系。各药物干预组与模型组对比均具有非常显著的差异,说明各给药组对缺血缺氧心肌细胞线粒体膜损伤均有改善作用。2.6.细胞凋亡：在TUNEL法检测细胞凋亡率中,模型组凋亡率与正常组对比明显上升,说明缺血缺氧造模后对心肌细胞凋亡的影响巨大,能够明显地发挥促凋亡作用。与模型组相比,曲美他嗪组及参高组、参低组、毛高组、人高毛高组、人高毛低组、人低毛高组都均有明显降低细胞凋亡率的作用,说明人参皂苷Rb1与毛冬青甲素联用及人身皂昔Rb1与毛冬青甲素单用对抑制细胞凋亡均具有显著作用。3.GS Rb1与IA干预缺血缺氧心肌细胞能量代谢的机制研究：3.1.能量代谢通路蛋白表达：观察各分组心肌细胞在缺血缺氧环境中能量代谢相关蛋白表达,模型组AMPK、PPARa、PGC-la、CPT-1、ACADM、NRF2、Tfam与正常组对比均有不同程度下降,Glut4蛋白表达量在造模后无明显变化。在给药后,曲美他嗪组与参高毛高组AMPK表达量明显高于其余各给药组,且参高毛高组蛋白表达量高于曲美他嗪组,P<0.01,结果具统计学意义。本次实验中未发现各药物对PPARa蛋白表达有明显促进作用。与模型组对比,参高组、参低组与模型组对比能够明显提高缺血缺氧心肌细胞PGC-la蛋白的表达量,两两对比P<0.01,差异具有统计学意义。参高毛高组、参高毛低组与模型组对比均有明显差异,都能够上调PGC-la蛋白表达量,P<0.01,结果具有统计学意义。参高组、参低组和参高毛高组、参高毛低、参低毛高、参低毛低组两两比较、存在量效关系,P<0.01,说明人参皂苷Rb1与毛冬青甲素联用对PGC-la表达量有明显促进作用,且与药物浓度密切相关。曲美他嗪能够明显降低缺血缺氧心肌细胞CPT-1蛋白表达,P<0.01,差异具有统计学意义。与模型组两两相比,参高组、毛高组、参高毛高组、参低毛高组对CPT-1蛋白表达有负性作用,P<0.01,结果具有统计学意义。各给药组与模型组对比蛋白表达趋势均有下降,说明人参皂苷Rb1与毛冬青甲素无明显促进脂肪酸代谢作用。除参低毛高组外,各给药组对ACADM均无明显促进或抑制作用。曲美他嗪组GLUT4蛋白表达量上可见明显升高,与模型组对比P<0.01,具有统计学意义,说明曲美他嗪能够显著地上调GLUT4蛋白表达,促进机体转运利用葡萄糖进入线粒体氧化功能。与模型组对比,参高组、参低组、毛高组、参高毛高组、参高毛低组与模型组两两比较均有明显促进作用,P<0.01,具有统计学意义。说明这几组药物配比与浓度可明显增加GLUT4蛋白表达量。参高毛高组与其他药物干预组两两比较p值均<0.01,具有统计学意义。参高毛高组在促进GLUT4蛋白表达与葡萄糖代谢中具有最优效用。在与模型组的两两比较中,各给药干预组均能够明显地上调NRF-2蛋白表达量,P<0.01,具有统计学意义。人参皂苷Rb1与毛冬青甲素对NRF-2蛋白有明显激活效用,曲美他嗪组与参高组、参低组、毛高组、参高毛高组、参高毛低组、参低毛高组两两比较结果无统计学意义,该几组具有相似的促进NRF-2蛋白表达作用。参高毛高组与其余各给药干预组的对比中P<0.0l,具有统计学意义,说明参高毛高组能够显著地促进NRF-2蛋白表达,在各组中具有最优效用。与模型组的比较中,各给药干预组均能够提高缺血缺氧心肌细胞Tfam蛋白的表达,P<0.01,且与正常组比较均有明显的调高现象,考虑与应激性药物刺激蛋白及线粒体的快速合成有关。在给药干预组中,参高毛高组与其他各给药组两两比较P<0.01,具有统计学意义。说明人参皂苷Rbl与毛冬青甲素高剂量配伍给药具有最优效用。3.2.高能磷酸化合物生成：观察各分组心肌细胞在缺血缺氧环境中能量代谢产物生成情况,模型组与正常组比较AMP含量明显增加,ADP、ATP含量显著下降,三者与正常组比较P<0.01,具有统计学意义在给药组与模型组AMP含量的两两比较中,各给药组都在一定程度上降低了缺血缺氧环境下心肌细胞AMP的含量,P<0.01,具有统计学意义。在降低AMP含量方面,参高毛高组、参高毛低组、参低毛高组能够明显降低AMP的效用。在给药组与模型组ADP含量的比较中,发现各给药干预组ADP含量均有升高,P<0.01,具有统计学意义。其中,曲美他嗪组与参高毛高组ADP含量无统计学意义,P<0.05,说明二者具有相似的升高ADP含量的作用。余组与ADP含量的提高大致呈量效关系。在给药组与模型组ATP含量的比较中,曲美他嗪组、参高组、参低组、参高毛高组、参高毛低组、参低毛高组均有明显提高ATP含量的作用,P<0.01,结果有统计学意义。毛高组、毛低组、参低毛低组在趋势上对促进ATP生成有一定表现,但与模型组比较P<0.05,无统计学意义。结论：1.心肌细胞缺氧1h起即出现缺氧损伤表现,以缺血缺氧6h为造模条件制备心肌细胞缺血缺氧模型成立。2.人参皂苷Rbl及毛冬青甲素对保护缺血缺氧心肌细胞形态学完整性、降低凋亡率、减少细胞脂质沉积、减轻脂质过氧化损伤、减少线粒体通透性转移孔的开放保护线粒体功能等都有明显作用。单药组中人参皂苷Rbl对心肌细胞的保护作用总体优于毛冬青甲素。3.AMPK-PGC-1α通路可能是调节缺血缺氧心肌细胞能量代谢的关键通路。人参皂苷Rbl与毛冬青甲素都能够明显激活AMPK-PGC-1α通路,刺激葡萄糖代谢与线粒体生成。人参皂苷Rbl能够降低AMP含量,促进ADP、ATP生成,改善缺血缺氧心肌细胞能量代谢。毛冬青甲素能够降低AMP含量,促进ADP生成,对ATP生成无明显作用。4.人参皂苷Rbl与毛冬青甲素高剂量联用在保护缺血缺氧心肌细胞形态学完整性、降低凋亡率、减少细胞脂质沉积、减轻脂质过氧化损伤、减少线粒体通透性转移孔的开放保护线粒体功能的作用方面较人参皂苷Rbl高剂量、毛冬青甲素高剂量明显提高,两药联用具有最优效用。其可能的机制是通过两药共同作用于AMPK-PGC-la能量代谢通路,促进葡萄糖氧化代谢、抑制脂质过氧化和促进腺苷酸合成。